利用rna干扰技术提高番茄抗tmv侵染能力的研究

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1、分类号Ｑ939.95学校代码10233密级公开学号10233120721硕士研究生学位论文题目:利用RNA干扰技术提高番茄抗TMV侵染能力的研究学科门类:理学一级学科:生物学二级学科:微生物学研究方向:植物微生物病害防治研究生:李猷指导教师:律凤霞教授答辩日期:2015年6月16日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的硏究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，包含为获得牡丹江师范学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。学位论文

2、作者签名签字日期年6月$0学位论文版权使用授权书本人完全了解牡丹江师范学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学院保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权牡丹江师范学院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。学位论文作者签名乘导师签名、pi芦签字曰期一f年(月曰签字曰期年^月0扫学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：中文摘要中文摘要烟草花叶病毒（TobaccoMosaicVirus,TMV）是RNA病毒

3、的一种，主要侵染烟草及其他茄科植物，在寄主体内完全寄生性生存，侵染植物危害严重，尤其是严重威胁栽培作物的产量和质量。番茄病毒病害在番茄生产栽培中危害较大，在我国大部分番茄栽培区内普遍发生。烟草花叶病毒就是其主要病毒病原这一。生产中普遍采用的防治手段是选育抗病品种，常规的杂交育种培育抗病品种存在一定的局限性，而RNA干扰（RNAinterference，RNAi）技术作为一种分子生物学手段为植物病毒病害防治开辟了一条新途径。基于RNAi机制，以TMV复制酶基因（TMV-replicase,TMV-r）为RNAi的靶向基因，在NC

4、BI网站对靶向基因进行序列同源性比对，确定RNAi的靶标序列，设计上下游引物，经RT-PCR从感染TMV病毒的烟草叶片中克隆靶向基因的靶序列片段。借助限制性内切酶将靶序列正向、反向构建到含35S超强启动子的RNAi表达载体相应克隆位点，特异引物PCR反应及酶切反应检测载体构建结构正确。经冻融法将表达载体重组质粒导入根癌农杆菌感受态细胞中，完成双元载体系统的构建。经叶盘法侵染番茄无菌苗，结合组织培养及激素诱导，通过抗生素选择性培养基筛选出9株番茄转化苗，继续培育后经特异引物PCR和NOS终止子引物PCR检测，确定3株为RNAi转

5、基因番茄苗。对转基因番茄人工接种TMV病毒并调查感病进展。结果表明：与非转基因对照番茄相比，转基因番茄对TMV的抗病能力显著提高，两株达到显著抗病水平。选取表现抗病毒能力的转基因番茄苗2株，普通对照番茄4株，对样品番茄的总RNA进行荧光定量PCR检测，分析番茄接种TMV病毒后的体内病毒复制酶基因mRNA表达丰度。结果表明：人工接种TMV病毒后，转基因番茄体内TMV病毒复制酶基因的表达量明显低于其它对照品种，其中达高度抗病水平的转基因番茄中病毒复制酶基因的mRNA表达几乎为零。说明RNAi转基因番茄对TMV的抗性能力源于靶向基因

6、的mRNA降解。关键词：番茄；烟草花叶病毒；载体构建；RNA干扰；转基因。IAbstractTobaccomosaicvirusisaRNA-virus,thatinfectsplants,especiallytobaccoandothersolanaceousplants,whichseriousthreattocropqualityandyield.Methodstocontrolwidelyusedisbreedingdisease-resistantvarieties,butithassomelimitations.R

7、NAinterferencetechnologyasanewmolecularbiologytechnicalhasopenedupanewroadtocontrollingvirus.OnthebasisoftheRNAinterference-mechanism,thesequenceofTMVreplicase-geneasbeenasthetargetsequenceofRNAiinthisexperiment.Theinvertedrepeatstructureoftargetsequencewasinsertedi

8、ntoRNAivectorwhichcontaining35Ssuperpromoter.ThantheRNAiexpressionvectorinfectedintoAgrobacteriumtumefaciensbyfreezethawingmethod,whichinf