杨树ccr基因rnai表达载体构建及其转化的研究

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1、摘要木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物，林木中木质素占木材干重的15％～36％，木质素生物合成及调节在植物生长和发育中发挥重要作用，另一方面，木质素是制浆造纸业的不利因素，脱除纤维素中的木质素，需要消耗大量能源和使用有毒化学物质，提高了造纸成本并污染环境。近十几年来，随着人们对木质素生物合成研究的深入，木质素生物合成途径许多酶的编码基因被不断分离克隆出来，调控木质素生物合成途径中重要酶基因的表达，通过抑制酶的活性，从而阻断木质素生物合成途径，降低木质素的合成量或单体组成，己经在烟草和杨树等植株上取得了成功。因

2、此，利用生物技术手段降低木质素含量或改变其组成，提高杨树的制浆性能，创造出符合造纸原料要求的林木品种，对于降低制浆造纸的经济成本和保护环境等都具有重要意义。CCR是木质素生物合成途径的关键酶之一，在木质素生物合成途径中处于终端位置。RNAi(RNAinterference)是一种重要的基因沉默方式，在植物基因功能和遗传改良研究中广泛应用。为优化和建立杨树遗传转化体系，探讨RNAi技术在杨树木质素改良中的应用效果，建立杨树RNAi的分子育种新方法，本文以南林95叶片为外植体，对农杆菌介导的遗传转化体系进行较系统地研

3、究，构建了肉桂酰辅酶A还原酶基因CCR干涉表达载体pBll21+2F，开展了农杆菌介导的杨树遗传转化，并对转化植株进行了筛选、PCR检测和木质素含量检测，获得了如下主要结果：1、采用改良的CTAB法提取南林95的基因组DNA，利用PCR技术克隆得到CCR基因的第4个外显子部分序列，并将其正向和反向克隆到pUCCRNAi载体上，通过酶切、纯化、连接、转化等一系列基因工程操作方法构建了含CaMV35S组成型启动子和卡那霉素筛选基因的RNAi表达载体pBll21+2F，并将其成功的导入农杆菌LBA4404中。2、以南林

4、95为试材，对其叶片再生体系进行了优化，建立了高效的叶盘法农杆菌遗传转化体系，并获得了经抗Kan筛选的RNAi片段的转基因植株。(1)以MS为基本培养基附加不同浓度的6_BA和NA_A，优化了南林95的组织培养扩繁体系，外植体培养基(MS+6_BA1．0meJL+NAA0．2mg／L+蔗糖20∥L+琼脂8e／L)诱导芽增殖，生根培养基为[1／2MS+NAAO．01mg／L+IBA0．2mg／L+蔗糖15g／L+琼脂8∥L1。(2)用导入pBll21质粒的农杆菌液转化南林95叶片，通过正交试验设计，建立了最佳遗传转

5、化体系，即外植体预培养7d，在含AS2001．tmol／L的菌液浓度为0．6的农杆菌液中侵染20min，共培养3d，其中适宜的Karl分化筛选浓度为50merlE，生根筛选浓度为30medL。(3)利用筛选出来的最佳遗传转化体系转化目的片段，获得了具有RNAi片段的转基因植株。3、对获得的转基因植株进行PCR检测，获得了RNAi片段的转基因植株。对培养3个月的转基因植株进行Klason木质素分析，与对照植株相比，木质素含量降低20％～30％，且转基因植株的形态和生长发育未见异常。结果表明，利用RNAi技术抑制CC

6、R基因表达，能有效降低植株的木质素含量。综上所述，通过构建CCR基因RNAi表达载体，建立杨树优良无性系叶片遗传转化体系，培育出速生、优质的杨树新品种，为进一步深入了解木质素生物合成提供了研究材料，也为其他树种的木质素基因工程改良奠定理论基础。关键词：杨树，RNAi，CCR，农杆菌介导遗传转化，木质素IIAbstractLigninis，secondtocellulose，themostabundantorganiccompoundintheterrestrialbiosphere．Indifferenttree

7、species，lignincontentvariesbetween15and36％ofthedryweightofwood．Ligninisamajorconstituentofcellwallsoffibersandtrachearyelementsandprovidesthesecellsrigidityforstructuralsupportandimpermeabilityforwatertransport．Fortheproductionofhigh_qualitypaper,ligniniscons

8、ideredasanegativefactorbecauseitmustbeextractedfromthecellulosefractionbyenergy-requiringandpollutingmethods．Forthisreason，thereisconsiderableinterestinmodifyingligninbygeneticengineering