大豆脂肪氧化酶基因rnai表达载体构建及表达调控的研究

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1、吉林农业大学博士学位论文大豆腊肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究摘要本项研究应用基因工程手段，克隆大豆脂肪氧化酶基因核心保守序列，构建高效的具有hpRNA和mpRNA结构的大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体。通过花粉管通道法将其导入大豆，抑制大豆脂肪氧化酶基因的表达，调控脂肪氧化酶的生物合成过程。以期通过基因工程手段，改变大豆脂肪氧化酶合成途径，降低大豆脂肪氧化酶含量，提高大豆油份含量，培育具有优良品质的大豆品种。取得如下结果：1．改造植物表达载体pCAMBIAl301，去除其臂内潮酶素基因，并在臂内按逆时针方向添加一个从

2、质粒pBll21上酶切下来的35S启动子。2．以大豆品种“吉农18号"的基因组DNA为模板，选取大豆三种脂肪氧化酶同功酶基因同源性最高部分，通过PCR扩增得到大豆脂肪氧化酶基因片段，将其克隆到pMDl8-Tvector载体上．测序结果表明：克隆片段大小为357bp。对比NCBI基因Bank，与已发表的基因一致。将大豆脂肪氧化酶基因片段按正向+反向的顺序插入到pCAMBIAl30135S启动子下，构建大豆脂肪氧化酶基因hpRNA干扰表达载体pCl301LoxRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号弦，获得To代转化籽粒，萌发后以单棵植

3、株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIAl301臂内GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从6棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于pMDl8．Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进一步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取2株进行Southernblot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，

4、转基因植株和非转基因植株的内标18S对蛆含量相同，而内源脂肪氧化酶mRNA的含量明显降低。3．克隆了大豆“吉农18号一自身的一段内含子，片段长度230bp，将其插入到表达载体pCl301LoxRi的正义基因片段和反义基因片段中间，构建大豆脂肪氧化酶基因mpRNA干扰表达载体pCl301LoxiRi。通过花粉管通道法转化大豆品种“吉农18号一，获得To代转化籽粒，萌发后以单棵植株叶片的总DNA为模板，以pCAMBIAl301臂内T-DNA区GUS基因设计一对引物进行PCR扩增，结果从18棵植株中扩增得到720bp的特异带，回收该条带连接于p

5、MDl8-Tvector载体并测序，结果显示其为要扩增的GUS基因片段。为进～步确定外源基因的整合情况，从PCR阳性植株中随机抽取3株进行Southernblot分析。结果表明，转化株均有杂交带出现，外源基因以单拷贝和双拷贝的形式插入，而未经转化的植株没有杂交信号出现，证明外源基因已整合到大豆基因组中。以转基因大豆籽IV吉林农业大学博士学位论文大豆脂肪氧化酶基因RNAi表达载体的构建及表达调控的研究粒的总RNA反转录成的cDNA为模板做RT-PCR，从电泳条带的亮度上看，转基因植株和非转基因植株的内标18SRNA含量相同，而内源脂肪氧化酶

6、mRNA的含量明显降低。4．以T1代转化的籽粒为材料，采用紫外分光光度法对脂肪氧化酶活性进行了测定，结果显示，转pCl301LoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性分别为降低62％，转化pCl301LoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶活性减低74％。说明外源基因的导入有效地抑制了脂肪氧化酶基因的表达。5．以T1代转化的籽粒为材料，采用SDS．PAGE电泳，结果显示转化pCl30ILoxRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低55％，转化pCl30ILoxiRi质粒大豆的脂肪氧化酶含量比对照平均降低71％。6．以Tl代转化的籽粒为材料，转基因植株蛋

7、白质的凯氏定氮和索氏提取测定结果显示，转基因植株蛋白质含量均有所下降，脂肪含量均有所上升：其中转化pCl301LoxRi质粒植株蛋白质含量平均为36．06％，比非转基因对照降低0．95个百分点(非转基因蛋白质含量37．01％)，最大降低1．28百分点达到35．73％，脂肪平均含量23．89％，比非转基因对照平均提高了0．74个百分点(非转基因脂肪含量23．15％)，最大提高1．09个百分点，达到24．24％；转pCl301LoxiRi质粒植株蛋白质含量平均为35．63％，比非转基因植株对照降低了1．38个百分点(非转基因蛋白质含量37．0

8、1％)，最大降低1．62百分点达到35．39％，脂肪平均含量24．33％，比非转基因对照平均提高了1．18个百分点(非转基因脂肪含量23．15％)，最大提高1．61个百分点，达到24．76％。