皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子纯化、性质、结构和功能的研究

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1、摘要凝血因子IX／X结合蛋白是近来发现的一类具有特殊性质的蛋白质。它们存在于蝰科蛇毒中，不具有酶活性，通过与凝血因子Ⅸ或凝血因子x结合来延长凝血时间。我们首次将它们归类为C一型动物凝集素超家族中一个亚家族一称为凝血因子IX／X结合蛋白家族。首次从皖南尖吻蝮蛇毒中分离出一种新的抗凝血因子ACFII，并发现ACFI和ACFII都是凝血因子IX／X结合蛋白家族的成员。本文对ACFI和ACFII的坌塞缝焦、生些!圭厦、酶学特性、坌王结撕噬凝机理进行了系统的研究。(全文分为七章。7＼．第一章：对蛇毒蛋白的研究概况、皖南尖

2、吻蝮蛇毒和抗凝血因子的研究进展进行了综述。第二章：首次系统地总结了蛇毒中一类不具有酶活性的抗凝蛋白的发现、结构、性质和功能，并将它们归类为一个新的蛋白家族一凝血因子IX／凝血因子x结合蛋白家族。第三章：建立了从皖南尖吻蝮蛇毒中纯化抗凝血因子ACFI和ACFII的高效简捷的分离方法，首次从皖南尖吻蝮蛇毒中分离纯化出一个新的抗凝血因子ACFII。纯化的ACFI和ACFII经PAGE、SDS．PAGE、IEF-PAGE和HPLC检测为纯蛋白。ACFI和ACFII的等电点分别为5．8和7．0。ACFII与ACFI一样，

3、不具有类凝血酶活性、纤溶活性和磷脂酶A2活性，没有出血活性和毒性，具有显著的抗凝血活性，是一种潜在的有重要医学价值的抗血栓药物。改进了测量抗凝血活性(PPT)的方法。第四章：对ACFI和ACFII的氨基酸组成、分子量、理化性质和活性等进行了系统的比较，发现ACFl和ACFn的差异属于抗凝血因子的微观不均一性范畴。它们都是由两条分子量相近的肽链通过二硫键连接在一起的。ACFI和ACFII除等电点有差异外，它们的氨基酸组成、分子量、紫外吸收系数、含糖量等都十分接近或相同。它们都没有蛋白水解活性、精氨酸酯酶活性和L一

4、氨基酸氧化酶活性，而且二者具有相同的抗凝血活性。第五章：首次发现皖南尖吻蝮蛇毒抗凝血因子ACFI和ACFII在抗凝血反应中存在一临界浓度，只有在高于其临界浓度时，才表现出显著的抗凝血活性。用聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱方法，发现ACFI和ACFII均与活化凝血因子X在钙离子作用下形成1：1的复合物。ACFI和ACFII都是凝血因子IX／X结合蛋白家族中新发现的成员。第六章：用平衡透析方法测定出ACFI和ACF11分子中都含有两个不同亲合性的钙离子结合位点，并首次测定出ACFI和ACFII与钙离子和部分稀土离

5、子的结合常数。稀土离子和钙离子在ACFI和ACFu分子中有共同的结合位点。稀土离子和过渡金属离子对ACFI和ACFII的内源荧光有不同程度的淬灭作用，而Ca2+对ACFI和ACFII的内源荧光有一定的增强作用。Ca2+对ACFI和ACF11分子中微区构象产生影响。稀土离子与ACFI和ACFII的荧光滴定表明，与稀土离子亲和性较低的位点在结构上有较大的柔性。第七章：用CD谱测得，天然ACFI和ACFII的二级结构十分相似，它们的主要骨架构象都为反平行p一折叠和a．螺旋结构。其中反平行p．折叠含量分别为26．5％和

6、26．2％；毡．螺旋含量分别为15．5％和13．7％。pH值增大时，ACFII的a．螺旋含量减少，而反平行6一折叠含量增大。钙离子和稀土、过渡金属离子对ACFII的主链骨架结构没有明显影响。卜。Ill±曼型兰垫查查兰苎主兰垡堡兰垒呈塑!塑THESTUDIESoNTHEPURIFICATIoN，CHARACTERIZATIoN，STRUCTI瓜EANDFUNCTIoNOF1rIIEANTICoAGULATIoNFACToRSFROMTHEVENoMoF461磁STRDDDⅣ彳C’U兀毽ABSTRACTThecoa

7、gulationfactorIX／factorX—bindingproteins(ⅨⅨ-bp)discoveredrecentlyarewidelypresentinthevenomofviperidaesnake，whicharenon—enzymaticanticoagulantsandforml：lcomplexes埘tllfactorIXorfactorXinthepresenceofCa2+ionsandprolongtheclottingtime．Theseproteinsarefirstclass

8、ifiedasauniquesubfamilyintheC-typeanimallectinsuperfamily,anddesignatedascoagulationfactorIX／factorX—bindingproteinfamily．AnovelanticoagulationfactorrACFIOisfirstisolatedfromthevenomofAgkistrodo