尖吻蝮(deinagkistrodon acutus)蛇毒中抑制回肠平滑肌收缩的蛋白组分(da-1)的分离纯化及其生化与药理研究

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1、^‘^I臾崎攻顼士学位论文蘼平漘肌收鑰的蚤会組分(Deinagkistrodonacutus)蛇.中抑制囬�及其生化与葯DA-1)的分禽此化a研秃刚指导教师：余晓东专业名称5生物化学与分子生物学^，/'AnvX舊研究方向：生物毒素与药物研发v>•>'•‘独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明。学位论文作者签名签字曰期以)

2、f年‘月3曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解重庆师范大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权一重庆师范大学_可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。学位论文作者签名:»丨H;]签字曰期^广年6月多曰重庆师范大学硕士学位论文尖吻蝮（Deinagkistrodonacutus）蛇毒中抑制回肠平滑肌收缩的蛋白组分（DA-1）的分离纯化及其生化与药理研究硕士研究生：刘刚指导教师：余晓东教授学科专业：生物化学与分子生物学所在学院：生

3、命科学学院重庆师范大学二○一五年四月AThesisSubmittedtoChongqingNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterPurification,BiochemicalandPharmacologicalCharacterizationofaNovelProtein(DA-1)fromtheVenomofDeinagkistrodonacutus:InhibitionofSmoothMuscleContractionCandidate:GangLiuSupervi

4、sor:ProfessorXiaodongYuMajor:BiochemistryandMolecularBiologyCollege:CollegeofLifeSciencesChongqingNormalUniversityApril,2015重庆师范大学硕士学位论文中文摘要尖吻蝮（Deinagkistrodonacutus）蛇毒中抑制回肠平滑肌收缩的蛋白组分（DA-1）的分离纯化及其生化与药理研究摘要尖吻蝮蛇（Deinagkistrodonacutus）又称五步蛇，为蝰蛇科蝮亚科毒蛇，是我国十大毒蛇之一，主要分布于我国南方地区。被该蛇咬伤的患者，常出现疼痛、出血、肿胀、肌

5、肉坏死等血循毒症状，也有少数患者出现眼睑下垂、呼吸困难等神经毒症状，这暗示着尖吻蝮蛇毒中可能含有神经毒素，但是，有关该蛇的这类神经毒性的毒理学活性、结构与功能的关系以及作用机理等尚不清楚。到目前为止，只见锯鳞蝰（Echiscarinatus）蛇毒能抑制回肠平滑肌收缩的报道。本研究首先确定尖吻蝮蛇毒是否具有抑制回肠收缩的活性，再从粗毒中分离纯化出具有该活性的目标蛋白组分，最后鉴定该蛋白的理化性质、生物学活性及药理活性等。通过三步柱层析法（SephadexG-50凝胶过滤层析，DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析和HitrapCaptoDEAE离子交换层析），从

6、尖吻蝮蛇毒中分离纯化出一种能抑制回肠平滑肌收缩的类神经毒性蛋白。还原性和非还原性SDS-PAGE均检测为单一泳带，显示该蛋白是由单一肽链组成，命名为DA-1。MALDI-TOF-TOF质谱测得其相对分子量为22,947.9Da。肽质量指纹图谱数据表明与其匹配度最高的蛋白为蛇毒金属蛋白酶。生化实验表明，DA-1可明显水解牛纤维蛋白原的Aα-和Bβ-链，但对γ-链无作用，且DA-1也可水解纤维蛋白单体。其纤维蛋白原水解活性可被金属螯合剂EGTA或EDTA完全抑制、β-巯基乙醇部分抑制，而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对水解活性无影响。小鼠背部皮下注射DA-1发现该蛋白具有明显的出血活性

7、。以上这些实验结果提示DA-1为一种出血性的金属蛋白酶。其他生化实验结果表明，该酶具有促水肿活性和磷脂酶A2（PLA2）活性，而无溶血活性。DA-1能抑制小鼠回肠平滑肌自发性收缩，并呈一定的量效和时效关系。在高剂量（12μg/ml）下，肌肉收缩幅度在22分钟时达到90%抑制率；同时，随着DA-1的剂量降低，肌肉收缩的抑制率也随着降低；实验证明即使是在高剂量（12μg/ml）下与回肠标本孵育60分钟，DA-1对小鼠回肠平滑肌的收缩频率亦没有影响。但是，在60分钟后对各个浓度作用的肌肉标本进行清