淋病奈瑟菌porb-1tb核酸疫苗构建及其免疫活性初步的研究

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1、淋病奈瑟菌porB．1tB核酸疫苗的构建及其免疫活性的初步研究硕士研究生：陈敏导师：胡四海教授中文摘要【目的】构建pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30a／ltB-porB原核重组质粒，转入E．coilBL21表达重组融合蛋白，分析蛋白的免疫原性和抗原性；构建pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-ⅥtB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB真核重组质粒，鼻饲免疫BALB／c小鼠，比较分析核酸疫苗的免疫活性，为研制淋病核酸疫苗提供实验依据。【方法】PCR法分别扩增目的基因p

2、orB、ltB、ltB-porB，采用基因克隆技术构建pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30a／ltB-porB原核重组质粒和pcDNA3．1(一)11)0m、．pcDNA3．1(-)／1tB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB真核重组质粒，PCR、双酶切及基因测序鉴定重组质粒构建是否正确。原核重组质粒pET30a／porB、pET30a／ltB、pET30dltB—porB转入E．coliBL21中，0．8mmol／LIPTG诱导带6-His的融合重组蛋白的表达，用带6-His组氨酸

3、标签的镍一琼脂纯化柱纯化重组融合蛋白，尿素浓度梯度法(6M-4M．2M．1M．0M)复性重组融合蛋白，Westem-blot分析蛋白抗原性。免疫新西兰兔四次后，收集血清，间接ELISA法分析复性重组融合蛋白的免疫原性。pcDNA3．1(·)／porB、pcDNA3．1(-妒tB-porB、pcDNA3．1(．妒tB真核重组质粒转染Hela细胞，用细胞免疫荧光法鉴定质粒在真核细胞内的表达。核酸疫苗pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-)／ltB-porB鼻饲免疫BALB／c小鼠，同时设对照组pc

4、DNA3．1(一)／ltB、pcDNA3．1(-)和PBS组，每次免疫后2w即下一次免疫前一天行小鼠尾静脉采血，分离血清，间接ELISA法检测血清中抗PorB的特异性IgG水平，冲洗小鼠生殖道，收集生殖道冲洗液，间接ELISA法检测冲洗液中抗PorB的特异性sIgA水平。末次免疫后2W取小鼠脾细胞于37"C5％C02培养箱中培养后，MTT法检测淋巴细胞的增殖。小鼠生殖道粘膜用免疫组织化学法检测PorB、LTB、LTB．PorB蛋白在体内的表达。．【结果】构建的pET30a／porB、pET30a／ltB、pE

5、T30a／ltB—porB原核重组质粒，转入E．coliBL21，IPTG诱导后均获得了重组融合蛋白表达，Western．blot分析表达的蛋白均有较强3的抗原性，能与抗PorB的特异性抗体结合。构建的pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(加tB、peDNA3．1(-)／ltB-porB真核重组质粒，转染Hela细胞，细胞免疫荧光法鉴定重组蛋白，均能在真核细胞内获得表达；核酸疫苗pcDNA3．1(一)／porB、pcDNA3．1(-)ntB、pcDNA3．1(一)／ltB-porB经鼻饲免疫BA

6、LB／c小鼠，末次免疫后2w取鼻部粘膜组织免疫组织化学法检测到重组蛋白能在小鼠鼻粘膜组织内表达。小鼠的生殖道冲洗液中能检测到抗PorB的特异性slgA，与对照组比较，实验组的slgA水平明显增高(尺0．01)，且含粘膜佐剂的pcDNA3．1(-ⅥtB—porB组较单基因pcDNA3．1(-)／porB组高(尺O．05)。实验组血清中抗PorB的IgG抗体，与对照组相比有明显差异(尺0．os)，但是pcDNA3．1(-MtB．porB组与单基因pcDNA3．1(-)／porB组比较则无差异(乃0．05)。与对照

7、组相比，实验组脾细胞增殖程度无明显升高(乃O．05)【结论】1．成功克隆TporB和ltB基因，并将两者融合，构建TItB、porB、以及ltB-porB融合基因+pET30a原核表达载体，目的基因均在E．coliBL21中表达出相应的重组融合蛋白，制备出高纯度的具有较强免疫原性和抗原性的融合蛋白。’2．成功构建TltB、porB、以及ltBl弦rB融合基因pcDNA3．1(．)真核表达载体，并分别在Hela细胞中获得表达。3．所构建的pcDNA3．1(-)／porB、pcDNA3．1(-)／1tB—porB

8、核酸疫苗，经粘膜途径免疫能够诱导小鼠产生特异性体液免疫反应，尤其是黏膜免疫应答。4．首次证实LTB作为黏膜佐剂与PorB融合，通过鼻黏膜免疫后能提高PorB诱导的特异性sIgA水平。【关键词】淋病奈瑟菌；PorB蛋白；粘膜佐剂LTB：融合蛋白：核酸疫苗基金项目：国家自然科学基金(No．30771931)4^·‘n’‘●1●⋯一一一-一Construction0InncleicaCldVacclnew