n-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的化学修饰

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1、http://www.paper.edu.cn1N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的化学修饰*翁秋萍，陆高圣，李环，韦萍南京工业大学制药与生命科学学院，南京（210009）E-mail：wqp8731650@126.com摘要：采用PMSF、NBS、DTNB、DEPC、WRK五种化学试剂，选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中丝氨酸的羟基、色氨酸的吲哚基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、天冬氨酸和谷氨酸的羧基，研究氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。结果显示，以DEPC、WRK修饰后，酶的活力明显下降，而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大，说明组氨酸和酸性氨基酸

2、可能为酶活性中心的必需氨基酸，而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的形成。底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用，保护作用随浓度增加而增加。关键词：N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶，活性中心，化学修饰，底物保护中图分类号：Q556文献标识码：Ａ大肠杆菌中argE编码的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithinedeacetylase,简称NAOase；EC3.5.1.16）催化N-乙酰鸟氨酸脱去乙酰基，生成L-鸟氨酸。该反应是精氨酸合[1-2][2][7]成关键的一步。NAOase可应用于氨基酸立体拆分、农林除草方面，同时

3、也具有潜在[1,5,7]的医药应用价值。因此对N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的研究具有重要的理论研究意义及生产价值。目前国内外对该酶的研究较少，国外对此酶的作用机理、底物特异性、基因序列、[1-6]对金属离子对其影响等方面方面有了一定的研究，国内主要研究了该酶的高效表达、纯[7～9]化和复性，及其发酵培养基的优化等方面，而对该酶的具体催化机制、酶的构象、活性[3-6]中心组成、底物和酶的结合位点、三维结构等基础性研究尚未见报道。蛋白质的化学修饰是研究酶的活性中心和探清酶必需基团组成的一个有效方法，也是研究蛋白质结构与功能的重要手段，对于空间结构未知的蛋白质分子

4、尤为重要。对蛋白质侧链[11]基团进行化学修饰，可以探明酶活性部位的结构。利用化学修饰的方法来探讨酶活性中[12-15]心已成为一种较为经典的方法。运用生物信息学软件预测出该酶的活性部位有两个金属离子结合位点，7个酪蛋白激酶II(CKII)磷酸化位点，2个蛋白激酶C磷酸化位点、5个N末端十四烷基化位点,无糖基化位点，而且活性中心可能含有组氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基。本文以SDS-PAGE电泳纯的N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶为研究对象，对其进行化学修饰研究，分析其活性中心可能的氨基酸残基，确定相应基团在活性中心中的作用，以期为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶结构与

5、功能之间的关系奠定了一定的研究基础。1材料与方法1.1主要材料菌种：基因工程菌BL21-pET22b(+)-argE，为南京工业大学制药与生命科学学院国家重点实验室构建。主要试剂：NBS(N-bromosuccinimide),DTNB(5,5-dithio-bis-(2-ni-trobenzonic-acid)，PMSF(phenylmethyl-sulfonyl-fluoride),WRK(N-ethyl-5-phenylisoxa-zolium-3-sulfo-1本课题得到国家973课题资助项目（NO.2003CB7160004）的资助。*通讯作者

6、。-1-http://www.paper.edu.cnnate)为Sigma公司产品。其它试剂均为国产分析纯。1.2主要仪器FPLC系统（ÄKTAexplore100，Amersham），紫外可见分光光度计（DU650Becman），超声细胞破碎仪（Ｙ92-2Ｄ型，宁波新芝），电泳设备（DYCZ-24E，北京六一），高速离心机（GL-21M型，上海市离心机械研究所）。1.3SDS-PAGE电泳纯NAOase的制备基因工程菌BL21-pET22b(+)-argE，经过诱导表达后，离心取菌泥，超声破碎，硫酸铵分级沉淀以除去部分杂蛋白。目的级分以Ni-NTA亲

7、和层析柱纯化。A相（50mmol/LPBS，pH7.4，含500mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑），洗脱缓冲液B相（50mmol/LPBS，pH7.4，含500mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑）阶段洗脱，收集洗脱峰检测蛋白含量和纯度。1.4酶的化学修饰分别用PMSF、NBS、DTNB、DEPC、WRK对酶进行化学修饰。各种化学修饰剂按表1缓冲溶液进行配制，配成所需浓度，然后稀释成一定系列浓度的溶液后与酶液混合反应，37℃作用一定时间，加入相应氨基酸溶液终止反应，测定NAOase的活性，以相同步骤不加修饰剂的酶活力为100%。1.5底

8、物对酶的保护作用以终浓度为5.0mmol/L，10.0mmol/L，25.0mm