棘白霉素B脱酰基酶产生菌转化条件的优化研究.pdf

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1、团2014，V。I．31N。．07亿与生物互程Chemistry&Bioengineeringdoi：10．3969,／j．issn．1672一一5425．2014．07．015棘白霉素B脱酰基酶产生菌转化条件的优化研究关亚鹏。娄忻，张莉，刘靓。佟杰(1．华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家工程研究中心河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，河北石家庄050015；2．华北制药集团股份有限公司，河北石家庄050015)摘要：为提高棘白霉素B脱酰基酶产生茵的转化率．通过紫外诱变复合Cu抗性处理筛选转化高产茵种，利用均匀设计方法优化菌种的转化工艺。结果表明，筛

2、选得到的突变株132的棘白霉素B转化率比出发菌株提高了22．6％，优化后的转化条件为：底物浓度2400“g·mL啊。。转化时间56h，转化温度30℃．发酵培养基PH值6．0。132菌株在优化转化条件下的转化率较出发茵株在原始转化条件下提高了57．3。优化的转化条件更有利于高产菌株的转化，转化率得到大幅提高，也为其工业化应用打下基础。关键词：脱酰基酶产生茵；诱变；均匀设计法；转化条件中图分类号：TQ465．92文献标识码：A文章编号：1672-5425(2014)07-0050—03棘白霉素类抗真菌药是一类最新型的广谱抗真菌发酵培养基：酵母粉，热榨豆饼粉，蔗糖，硫酸镁，

3、药，能够抑制真菌细胞壁的合成，对念珠菌属和曲霉属K2HPO4·3H2O，pH值6．5。等引起的深部感染均有效，这类药物抗菌谱广、毒性1．2摇瓶培养低、无交叉耐药性，对治疗严重感染具有广阔的应用前将成熟斜面接种至种子培养基，于28℃、220r·景。目前已上市的该类药物包括卡泊芬净、米卡芬净rain摇床培养48h后，以5的接种量接入发酵培和阿尼芬净引。脱酰基酶产生菌可以将米卡芬净和养基，于28℃、220r·min-1培养4d后补入已知浓度阿尼芬净的前体物质FR901379和棘白霉素B脱去酰的底物(棘白霉素B)至培养基中底物终浓度为基侧链形成母核(中间体)，由母核进而合成米

4、卡芬净1800p．g·mL_。，继续转化48h。转化结束后利用或阿尼芬净HPLC法测定发酵液效价，计算转化率(发酵液效价与作者以棘白霉素B为前体物质，研究脱酰基酶产底物添加量的比率)。生菌转化阿尼芬净中间体的条件，首先利用紫外诱变1．3菌种诱变与筛选复合Cu。抗性处理筛选脱酰基酶产生菌高产菌种，之1．3．1紫外诱变处理后以均匀设计方法对高产菌种的转化条件进行优化，将供试菌种斜面制得的单孢子悬液置于平板中，拟为其工业化应用奠定基础。紫外灯(30W，254nm，36cm)下照射15S，孢子液逐级稀释到合适浓度后涂布到固体培养基平板上，28℃1实验下培养8d，进行摇瓶筛选。

5、1．1菌种与培养基1．3．2紫外诱变复合Cu抖平板抗性处理棘白霉素类化合物脱酰基酶产生菌ZH一1020，自制备含有0．02、0．04、0．069／6CuSO的平板行保存。培养基，将紫外照射处理过的孢子液适当稀释后涂布固体培养基：葡萄糖，酵母粉，复合维生素B，微量于该平板上，培养8～i0d后挑选孢子丰富、菌落相对盐。较大的抗性菌落移至斜面，再进行摇瓶筛选。种子培养基：糊精，葡萄糖，酵母粉，玉米浆，1．4均匀设计实验FeSO4·7H2O，K2HPO4·3H2O。温度、pH值等外界环境对转化菌内酶的启动和收稿日期：2014—03—12作者简介：关亚鹏(1982一)，女，河北

6、石家庄人，硕士，工程师。研究方向：微生物药物产生茵的遗传育种研究，E-mail：gYP一05@163．com通讯作者：佟杰，高级工程师，E—mail：tongjie@ncpc．corn。关亚鹏等：棘白霉素B脱酰基酶产生菌转化条件的优化研究／2014年鞠7期表达有着非常重要的影响。设定转化温度(℃)、发酵表3132菌株摇瓶筛选结果／％培养基pH值、底物浓度(p-g·mL)、转化时间(h)为Tab．3Flaskfermentationresultsofstrain132／％自变量X、。、X和X，相对转化率为因变量，进实验批号相对转化率行4因素3水平的均匀设计实验优化脱酰基

7、酶产生菌的转化条件，各因素及水平见表1。2表1U，(3)均匀设计实验的因素和水平平均值Tab．1ThefactorsandlevelsofU9(3)uniform注；转化率为相对值，即出发菌株的转化率以100计designexpedment表4均匀设计实验结果rab．4Resultsofuniformdesignexperiment2结果与讨论2．1摇瓶筛选结果(表2)表2紫外诱变复合cu抗性处理结果／％Tab．2ResultsofUVirradiationcombinedwithCu+resistanceselection／％注：CK组为13z#菌