鸭肝炎病毒vp1基因的克隆与表达

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2、权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国兽医药品监察所可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：时间：彤年石月伊日时间：剔／7年∥序喀日．关号氟夥瓦鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(DuckhepatitiSvirus，DHV)引起的以快速传播为特点的急性致死性传染病，主要引起3周龄内的雏鸭发病和死亡。该病病程短，死

3、亡率高；临床表现主要为角弓反张；病理变化以肝脏的肿大、坏死、出血为主要特征。在我国同时存在l型鸭肝炎病毒(DHV一1)和新型鸭肝炎病毒(N—DHv)的流行。鸭肝炎病毒的VPl蛋白是诱导中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。本试验首先尝试利用原核表达系统表达DHVVPl蛋白，但由于基因结构问题全长基因不能成功表达，切去5’端135个碱基后，构建表达质粒pET32a—VPl，DH＼，一1VPl基因在大肠杆菌中成功表达大小为41KD左右的重组蛋白，但Western-blot检测和ELISA试验证明表达的目的蛋

4、白不能与相应的特异性抗血清发生反应，说明在VPI基因序列可能没能在原核表达系统中有效表达。而N—DHVVPI基因不能在大肠杆菌中表达。使用Bac—to-Bac杆状病毒表达系统对VPI基因进行了克隆与表达。针对DHV一1和N—DHV的VPl基因设计两对特异性引物，使用RT—PCR方法扩增得到DHv一1YB3株和N—DHVGD株的VPl基因，将目的基因分别克隆至转移载体pFastBacHTA上，构建重组转移载体pFastBacHTA—YB3一VPl年HpFastBacHTA—GD—VPl，再将重组质粒转化到DHI

5、OBac细胞中，获得重组穿梭载体Bacmid—YB3一VPI和Bacmid-GD-VPl，转染sf9昆虫细胞，获得重组杆状病毒vBac—YB3矛HvBac—GD。将重组杆状病毒进行扩增繁殖，获得第三代的重组病毒，使其在昆虫细胞中表达外源蛋白，并对其条件进行优化。结果表明，在SDS—PAGE蛋白胶上有大小约为30KD左右的特异性蛋白条带，且Western—blot检澌DELISA试验证明表达的重组蛋白与相应的抗血清具有良好的反应性，且二个血清型之间无交叉反应。本研究为今后利用重组蛋白建立血清学诊断方法和亚单位疫

6、苗的研制奠定了基础。关键词：鸭肝炎病毒VPl基因原核表达系统昆虫杆状病毒表达系统中国兽医药品监察所硕士学位论文ABSTRACTDuckviralhepatitis(DVH)causedbyduckhepatitisvirus(DHV)isanacuteandfatalinfectiousdiseasewhichspreadsrapidlyinducklingswithin3weeks。Thediseasehasashortdurationandahighmortality．Opisthotonoscanbeo

7、bservedinclinicalsymptomsandpathologicalchangesaretheswelling，necrosisandhemorrhageoftheliver．TheDVHcausedbyduckhepatitisvirustype1(DHV-1)andduckhepatitisvirusnewserotype(N—DHV)hadbeenapprovedtospreadwildlyinChina．VPlproteinofDHVisthemostantigenicproteinbei

8、ngresponsibleforinducingneutralizingantibodiesandinspiringaprotectiveimmunity．Prokaryoticexpressionsystemwasattemptedtoexpresstheprotein，butnoproteinwasobtainedowingtothegenestructure．Afterremovalofthe