大白菜brant基因克隆及功能分析

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学博士学位论文大白菜BrANT基因克隆及功能分析CloningandfunctionanalysisofChinesecabbageBrANTgene（BrassicarapaL.ssp.pekinensis）指导教师姓名张建农研究员（甘肃农业大学园艺学院兰州730070）高建伟研究员（山东省农业科学院济南250100）学科专业名称蔬菜学研究方向蔬菜种质资源创新与新品种选育论文答辩日期2015年5月28日学位授予日期答辩委员会主席谢忠奎研究员评阅人侯喜林教授匡汉晖教授史庆华教授2015

2、年6月甘肃农业大学2015届博士学位论文摘要大白菜（BrassicarapaL.ssp.pekinensis）起源于中国，是我国的特产蔬菜。长期以来，大白菜一直是我国和东亚国家栽培面积最大的蔬菜作物之一。经过漫长的自然进化和长期的人工栽培、选育，大白菜逐步形成了以储藏营养为功能的叶球，叶球是食用的最主要器官。叶球的大小是一个重要的产量性状，也是一个重要的商品性状。随着生活水平的不断提高，人们对大白菜叶球的大小提出了多种需求。大白菜叶球大小发育的分子调控机制及其在育种实践中的有效利用是一个重要的科学问题。但是，到目前为止，人们对大

3、白菜叶球大小发育的分子调控机制知之甚少。通过对模式植物拟南芥的研究，人们发现隶属于AP2亚家族转录因子的ANT（AINTEGUMENTA）是控制叶子等器官大小发育的重要因素之一。本研究利用大白菜基因组数据，在全基因组水平上分析了大白菜AP2亚家族的成员组成、结构域构成、对应基因的结构、表达模式，并以BrANT2基因为代表研究了AP2亚家族基因在控制叶球等器官大小方面的生物学功能。由于大白菜ANT基因对叶球大小发育的调控是一个复杂的生物学过程，涉及到多个基因的协同作用，因此我们又利用高通量转录组测序（RNA-Seq）技术研究了Br

4、ANT2基因过量表达后其它基因的转录表达差异情况。主要结果如下：1.大白菜AP2蛋白亚家族的生物信息学分析依照大白菜基因数据库测序数据（Chiifu）发现大白菜基因组中共存在24个AP2亚家族成员，它们不均匀地分布在10条染色体上，编码区（CDS）长度为549-1740bp。24个AP2亚家族成员包含的内含子数目也呈不均匀分布，但多数成员含有6个内含子。通过对24个成员的蛋白质序列特征进行分析，我们发现所有成员均具有两个相对保守的AP2结构域(R1，R2)。根据R1，R2氨基酸组成的数目，我们将AP2亚家族分为7个类型，其中‗7

5、3，65‘型、‗70，65‘型、‗63，64‘型为三个主要类型。根据系统进化树的分析结果，我们将大白菜AP2亚家族成员分成Ⅰ-Ⅷ8个分枝，其中大白菜BrANT成员聚类于Ⅵ号分枝上；在进化上，大白菜和拟南芥之间具有比水稻更近的亲缘关系。2.大白菜BrANT蛋白家族的表达模式分析采用RT-PCR方法分析了大白菜BrANT基因在大白菜根、短缩茎、老叶、幼叶、花和花蕾六部分组织中的表达模式，结果表明：BrANT家族成员在不同组织中的表达存在较大差异。通过对大白菜BrANT基因在NAA处理后不同时间点成熟叶中的表达模式分析，我们发现大白菜

6、BrANT基因在NAA早期响应中上调表达，后逐渐趋于正常。进一步的研I甘肃农业大学2015届博士学位论文究发现，不同家族成员之间的表达模式存在一定的差异，但具有相同结构域组成的成员具有类似的表达模式。上述结果表明：不同家族成员在大白菜叶球等器官发育调控中可能发挥不同的作用。3.大白菜BrANT2的克隆和功能分析为更好研究BrANT基因家族的生物学功能，我们选择了大白菜BrANT2基因为代表进行分析。大白菜BrANT2基因位于第3号染色体上，基因全长为2250bp，编码区（CDS）长度为1671bp，编码556个氨基酸残基。利用R

7、T-qPCR分析大白菜BrANT2基因在叶球大小不同的品种之间结球期的表达模式，我们发现BrANT2基因表达量与叶球大小呈正相关。在拟南芥中过量表达BrANT2基因可显著提高转基因植株叶子等器官的大小，同时种子的千粒重也增加。因此，我们可以将BrANT2基因应用于大白菜、油菜等十字花科蔬菜作物遗传改良中，利用分子育种手段提高这些蔬菜作物的经济产量，增加其经济效益。4.野生型及其转基因（35S:BrANT2）拟南芥转录表达谱分析利用高通量转录组测序技术对播种后30天的转基因（35S:BrANT2）拟南芥及其野生型叶中的基因转录表达

8、谱进行了分析。结果表明，在野生型拟南芥和转基因（35S:BrANT2）拟南芥中共有119个基因存在显著表达差异，其中40个基因在转基因（35S:BrANT2）拟南芥中显著上调，79个基因在转基因（35S:BrANT2）拟南芥中显著下调。通过对差异表达基因的深入分