全合成纳米抗体文库的设计、构建及鉴定

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1、全合成纳米抗体文库的设计、构建及鉴定TheDesign,ConstructionandIdetificationofaFullySyntheticNanobodyLibrary学科专业：生物化工研究生：秦秀峰指导教师：甘一如教授天津大学化工学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

2、学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要合成抗体文库是选用经过优化的抗体序列作为骨架区，与天然的或人工合成的互补决定区（Complementaritydeterminingregions,CDRs）拼接构建而

3、成，具有设计灵活，可控性强，库容量大以及多样性好的优点。合成抗体文库已成为天然文库和免疫文库的补充，是筛选高亲和力抗体的重要来源，对于抗体药物的研发有显著意义。本课题设计、构建了全合成纳米抗体文库并进行了初步评价，以HIF-1α-PAS-B为抗原，从抗体文库中筛选特异性纳米抗体，验证抗体文库的生物学活性。首先，通过对天然纳米抗体文库大规模测序以及测序结果的比对，确定要构建的全合成纳米抗体文库骨架区序列和CDRs区氨基酸数目，随后合成VHH模板序列并组装至pCantab5E噬菌粒载体上。其次，用NNK随机化的方法在三个CDRs区随机引入突变，通过重叠延伸PCR获得VHH

4、全长片段并克隆至pCantab5E噬菌粒载体上，电转大肠杆菌TG1获得全合成纳米抗体文库，从库容、抗体基因插入率以及多样性等方面评价抗体文库。经鉴定，构建的全合成纳米抗体文10库多样性良好，库容为4.2×10CFU，VHH基因插入正确率为82%。最后，为了验证抗体文库的生物学活性，制备了HIF-1α-PAS-B蛋白作为抗原，应用噬菌体展示技术从全合成纳米抗体文库中筛选得到特异性纳米抗体。关键词：合成文库，纳米抗体，噬菌体展示技术，乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）I万方数据ABSTRACTThesyntheticantibodylibrarieswerebasedon

5、asetofoptimizedframeworks.Syntheticelementswereintroducedintothenaturalspaceofantibodies.Ithasadvantagesoflargesequencediversitiesandlargelibrarysize.Thesyntheticantibodylibrarybecomesasupplementofimmunelibraryornaïvelibraryandhasacrucialfuctiononthedevelopmentofantibodydrugs.Inthisstud

6、y,afullysyntheticnanobodylibrarywasconstrucedandidentified.Toverifythebiologicalfuctionsofthenanobodylibrary,anti-HIF-1α-PAS-Bnanobodieswerescreened.Firstly,thisfullysyntheticnanobodylibrarywasbasedontheframeworkoriginatingfromawell-expressedNaïvenanobodylibrary.Thesequenceofframeandthe

7、numbersofaminoacidintheCDRsweredeterminedthroughanalyzingthesequenceofNaïvenanobodylibrary.ThesequenceofVHHwassynthesizedandinsertedintothephagemidvectorpCantab5E.Secondly,diversitywasintroducedintheCDRsthroughtheuseofthedegeneratecodonNNK.TheVHHfragmentswereconstructedbyoverla