牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白ernse2的原核表达及噬菌体展示anti-bvdv纳米抗体文库的构建

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1、分类号：密级：学号：2010108036单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白Erns/E2的原核表达及噬菌体展示anti-BVDV纳米抗体文库的构建学位申请人肖红冉陈创夫教授指导教师王鹏雁副教授申请学位类别农学硕士专业名称预防兽医学研究领域畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ProkaryoticexpressionofbovineviraldiarrheavirustheenvelopeproteinErns/E2andconstructp

2、hagedisplayanti-BVDVNanobodylibraryADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByXiaoHongran(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuAssociateProf.WangPengyanJ

3、une,2013课题来源课题名称:国际合作项目（牛病毒性腹泻/粘膜病防治新技术）课题编号:2013DFR30970中文摘要牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovineviraldiarrhea/mucosaldisease）是由牛病毒性腹泻病毒引起的、主要发生于牛的一种急性、热性传染病，其临诊特征为黏膜发炎、糜烂、坏死和腹泻。本病呈世界性分布，广泛存在于欧美等许多养牛业发达的国家。自1980年以来我国从国外引进奶牛和种牛，将本病传入我国，并对病毒进行了分离鉴定。发达国家针对感染牛群多采取大量淘汰或屠杀，目前尚无有效

4、的疫苗对BVDV进行预防，给畜牧业生产造成巨大的经济损失，促使人们不断寻求新的防治BVDV的途径，以便更好的控制该病的发生和流行。自杂交瘤细胞技术问世，单克隆抗体已被广泛用于疾病的诊断和治疗。抗体来自于有机体，使用过程中无毒性，在人们看来抗体用于治疗疾病似乎具有无限的潜力。然而传统的单克隆抗体依然存在各种缺陷，比如：体积大、稳定性差、制备工艺繁琐、耗资高、必须人源化等。驼科动物和鲨鱼体内存在一种特殊的天然缺失轻链的重链抗体。这种重链抗体的可变区序列具有体积小、容易获得、高水溶性和稳定性、能够识别沟槽或缝隙

5、间的抗原表位及结合活性好等优点，被称作是单域抗体，又称纳米抗体。鉴于单域抗体的这些优点，已被广泛应用于临床诊断和治疗。本项研究根据GenBank公布的BVDV-NADL株Erns(E0)、E2基因的核苷酸序列，设计引物，采用PCR技术从pACNR/NADL质粒中扩增Erns、E2基因，构建原核表达质粒pET-32a-Erns、pET-32a-E2，将其转化至大肠埃希菌BL21中，经IPTG诱导，用SDS-PAGE及Westernblot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性。将牛病毒性腹泻病毒接种长满单层的M

6、DBK细胞，接种72h后，收取病毒液。将全病毒灭活，免疫双峰驼。分离外周血淋巴细胞，并提取总RNA，反转录成cDNA。采用巢式PCR技术扩增重链抗体可变区基因的核苷酸序列，构建噬菌体展示载体，经过多次连接转化TG1感受态细胞，构建初始文库。利用M13KO7辅助性噬菌体超感染构建噬菌体展示anti-BVDV纳米抗体文库。本试验成功构建牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白Erns、E2的原核表达载体，经诱导表达目的蛋白分别为45KD、64KD左右，经Ni-NTA蛋白纯化仪纯化蛋白，获得纯度较高的蛋白。Westernblo

7、t试验表明目的蛋白具有很好的反应原性。以cDNA为模板，扩增驼源重链抗体可变区序列，构建库容量为4.32×105初始文库。辅助噬菌体救援后，获得噬菌体展示纳米抗体文库，滴度达1.3×1011。为后续利用BVDV的囊膜蛋白Erns、E2作为抗原筛选具有高亲和力、高特异性的抗BVDV的纳米抗体奠定基础。关键词：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；Erns、E2蛋白；纳米抗体；噬菌体展示文库IAbstractBovineviraldiarrhea/mucosaldisease(BVD-MD),causedbyBVDV

8、isanacutefeverishandhighlycontagiousdisease.Themainclinicalcharactersofthediseasearemucosalinflammation,erosion，necrosisanddiarrhea.Thediseaseiswidelyspreadedintheworld,expeciallyinEuropeandtheUnitedStates,otherdeve