活性位点邻近的ω-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响

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1、活性位点邻近的Ω-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响TheeffectoftheΩ-loopwhichisnexttotheactivesiteonthestabilityandactivityoftrypsin工程领域：生物工程作者姓名：杜坤指导教师：甘一如教授企业导师：王大梅教授级高工天津大学化工学院二零一七年五月万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过

2、的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日万方数据摘要摘要在医药科研等领域，胰蛋白酶作为一种非常重要的工具酶，应

3、用十分广泛。通常，胰蛋白酶以从哺乳动物胰液中提取为主，工艺简单，但容易携带病原菌，导致产品质量不均一。因此，开发一种高效稳定的胰蛋白酶的生产方法成为当前工业所迫切的需求。同时，胰蛋白酶只能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，样品在用胰蛋白酶处理前，若用化学变性剂处理往往导致样品的后续检测过程复杂化，不利于样品的快速分析。而高温下进行胰酶酶切处理，酶切蛋白遇高温变性，避免了化学变性剂的使用。因此本研究针对胰蛋白酶热稳定性，进行了理性设计研究，以期提高其热稳定性。本实验以猪源胰蛋白酶作为研究对象，首先通过分子动力学模拟软件Gromacsv4.

4、5.5软件，预测出了胰蛋白酶的柔性区。然后根据删除Ω-loop结构中氨基酸数目的不同和可糖基化位点的潜在可能，初步确立了突变位点R1Q，K3Q，C5Q以及M77，M81；通过重叠延伸PCR技术和定点突变技术构建突变菌株，发酵表达后，进行了酶热稳定性和活性的分析。结果表明，R1Q，K3Q以及C5Q的活性在一定程度上均有提高，R1Q，K3Q在热稳定性上也有所提高，其中R1Q突变体酶的最高活性较野生型提高了1.42倍，同时，失活半衰期（t1/2）较野生型也提高了213.3min。突变型M77相比于野生型其半衰期提高了156.9min，M81相比于野生型

5、则提高了189.5min，最高活性分别提高至野生型的1.5倍和1.4倍。R1Q，M77及M81的最适反应温度也均由原野生型胰蛋白oo酶的75C提高至85C。综上，本实验实现了酶双功能的共同进化，成功应用于猪源胰蛋白酶的热稳定性和活性的改造，并为其他工业用酶的热稳定性和活性改造提供了借鉴的思路。关键词：胰蛋白酶，Ω-loop，糖基化，热稳定性，活性万方数据ABSTRACTABSTRACTAsanimportanttoolenzyme,trypsinhasbeenusedformanyfieldsincludingpharmaceuticalands

6、cientificresearch.Inindustry,extractionformpancreasjuiceistheconventionalmeansfortrypsinproductionforitslowcostandeasyprocess.Whileinhomogeneitybetweendifferentbatchofproductsandresidualpathogenicmicroorganismsmakeitinurgentneedofdeveloppingamatureapproachtoachievetrypsinwith

7、highsaftyandquality.InMSassayofnovelproteins,denaturantsusuallycomplicatedsubsequentanalysis.Whileinhightemperature,denaturedproteincouldbedigestedbytrypsinwhichavoidstheapplificationofdenaturants.Thusthereisaneedtoengineeringthermostabilityoftrypsinbyrationaldesign.Inthisres

8、earch,weattemptedtoimprovethethermostabilityandactivityofporcinetryp