油橄榄乙烯生物合成途径中两个关键酶基因的克隆及ACC氧化酶基因的原核表达研究

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1、？１１分类号：Ｓ２０３２１４：０８２学号１四川农业大学ｔＪｒ学＾位论文油橄榄乙烯生物合成途径中两个关键酶基因的克隆及ＡＣＣ氧化酶基因的原核表达研究朱庆平指导教师黄乾明教授学科专业生物化学与分子生物学研究方向基因工稈Ｖ２０１６年１１月＼ＣｌａｓｓＮｕｍｂｅｒ：０８１２ＳｔｕｄｅｎｔＮｕｍｂｅｒ：Ｓ２０１３１２１４ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｇｙＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＰａｒｔｉａｌＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔ

2、ｏｆｔｈｅＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥＳｔｕｄｙｏｎｃｌｏｎｉｎｇｏｆｔｈｅｔｗｏｋｅｙｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓｉｎｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｏｓｎｔｈｅｓｉｓａｔｈｗａｏｆＯｌｅａｅｕｒｏａｅａＬ．ａｎｄｒｏｋａｒｏｔｉｃｙｐｙｐｐｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＡＣＯｉｎＥ．ｃｏｌｉＺｈｕｎ－ｉｉｎＱｇｐｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆａｎ－ｍｎ．ＨｕａｎｇｉｉＱｇ’ＳｉｃｈｕａｎＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔＹａａｎ６２５

3、０１４ＳｉｃｈｕａｎＰ．Ｒ．Ｃｈｉｎａｇｙ，，，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２０１６论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机一构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。Ｃ？研究生签名：年／拥心关于论文使用授权的声明？、．本人完全了解四川农业大学有关保留使用学

4、位论文的规定，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。Ｅ本论文不保密。口本论文保密，在解密后适用本授权。＿年“”（请在以上口内划Ｖ）研宄生签名：年切＞、ｍ１ｙ〇导师签名：年月日＜＾１＆丨ｑ摘要油橄榄ＯｆｅａＬ．ｌｅａｃｅａｅｌｅａ为木犀科（Ｏ木渾榄属（Ｏ常绿乔木，原产于小亚（）））“一细亚，是世界上著名的四大木本油料作物之

5、。经油橄榄果实榨取的橄榄油被誉为植”“”物油皇后和液体黄金，其中富含不饱和脂肪酸和大量生物活性物质，使其具有极一一。乙高的营养价值，是当前世界上所公认的最健康的食用油之烯是种极其重要的气，，在体植物激素，影响植物花朵和果实的衰老和脱落响应植物受到的逆境胁迫等植物的生命周期中发挥着重要的生理功能。因此，乙烯严重影响油橄榄果实的品质和产量，进而影响油橄榄的营养价值和经济价值。目前，ＡＣＣ，高等植物乙烯生物合成途径己研宂得比较清楚合成酶－－ａ－１ｍｉｎｏｃｃｌｏｒｏａｎｅ１ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓ

6、ｅＡＣＳ和ＡＣＣ氧化酶（ｙｐｐ，）－－－ａｍｎｏｃｃＡＣＯ２１ｉｙｌｏｒｏａｎｅｌｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｏｘｉｄａｓｅ是植物乙稀合成途径中个关键（ｐｐ，）。ｅｖｅｒｓｅｒａｎｓｃｒｉｉｏｎ酶，直接影响着植物内源乙炼的产量本研宄采用反转录ＰＣＲ技术（Ｒｔｐｔｏｍｅａｓｅｃｈａ－ｉｎｅａｃｉｏＲＴ、ｉｄｌｉｆｉｃａｔｉｏｆｃＤＮＡｅｎｄｌｒｒｔｎＰＣＲ末端快速扩增技术（Ｒａａｍｎｏｐｙ，）ｐｐ，ＲＡＣＥ）、ＤＮＡＷａｌｋｉｎｇ技术融合引物嵌套ＰＣＲ（Ｆｕｓｉｏｎｐｒｉｍｅｒａｎｄｎｅｓ

7、ｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｅｄＰＣＲ，一－ＦＰＮＩＰＣＲ以及个油橄榄转录组数据库等分子生物学技术和数据库，分别从油橄榄果）实ＤＮＡ和总ＲＮＡ中克隆扩增出１个油橄榄ＪＧＳ基因的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ序列，３个油橄、榄』ＣＤ基因的ＤＮＡ和ｃＤＮＡ序列，并对其进行了相关的生物信息学分析，这４个基因０以０５一６分别命名为、＜９以（：０／、０＆＾０２和为了进步验证０ＡＣ０１、０ｅＡＣ０２和０ｅＡＣ０３的生物学功能，对克隆扩增得到的３个ＯｄＣＯ基因在大肠杆菌ＢＬ２１ＤＥ３（）进行了异源表达，并对重组蛋白的酶活性进行了分析。得到了如下主要研

8、究成果：１．０＆４ＧＳ基因的ＤＮＡ长度为１８８２ｂｐ，ｃＤＮＡ长度为１４２３ｂｐ，含有４个外显子和３个内含子，开放阅读框编码４２３个氨基酸