虫生真菌几丁质酶基因的克隆、原核共表达及生物活性研究

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1、中文摘要虫生真菌的几丁质酶基因的克隆、原核共表达及生物活性研究微生物农药由于具有广泛的生产原料，防治对象不易产生抗药性，对环境友好等特点,而逐步成为生物防治的支柱产业。其中，球孢白僵菌（Bassianabassiana）和蜡蚧轮枝菌（Verticilliumlecanii）是目前研究最多、应用最广泛的昆虫病原真菌。之中的几丁质酶是虫生真菌的最主要杀虫活性物质。但是由于有些病原真菌细胞壁也含有几丁质，所以这两种病原微生物的几丁质酶对病原真菌也有抑制作用。本文以球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌两种虫生真菌为主要研究对象，研究通过克隆球孢白僵菌和蜡蚧轮枝

2、菌的几丁质酶基因，并在大肠杆菌中原核共表达,研究融合蛋白的抑菌活性。由于它们来源不同的菌株，二者结合使用可以作为一种新型生物农药应用于病虫害防治。通过基因融合表达，一次发酵即可生产高效的生物农药，缩减生产成本，有效的抑制病害的抗药性。所以本研究结果如下：1.本研究根据球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌的序列信息设计引物，通过PCR的方法，克隆得到球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌的几丁质酶基因，球孢白僵菌几丁质酶基因全长1047bp，编码348个氨基酸，蛋白质分子量为38.4kD，等电点为5.94。蜡蚧轮枝菌的几丁质酶基因全长1272bp，编码423个氨基酸，蛋

3、白分子量为46.7kD。分别构建几丁质酶基因原核表达载体，转入大肠杆菌BL21原核表达，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白正常表达，并且发现在大肠杆菌BL21中蛋白表达量在4h达到最大。2.本研究将构建球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌的几丁质酶基因在大肠杆菌BL21中融合表达，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白正常表达，并且发现在大肠杆菌BL21蛋白表达量在4h达到最大。3.本研究通过对峙培养法测定三种蛋白裂解液对玉米大斑病菌和核盘菌的抑菌活性；测定了不同浓度蛋白裂解液对玉米大斑病菌菌丝生长的抑制效果；采用离体叶片法，测定不同浓度蛋白裂解液对玉米叶片上

4、的玉米大斑病的防治效果。同时还测定了不同浓度蛋白裂解液对大豆核盘菌菌丝生长的抑制效果；I同时测定不同浓度蛋白裂解液对番茄叶片上的大豆核盘菌的抑制效果。结果表明球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌几丁质酶蛋白的抑菌活性无显著差异，但是其融合表达的几丁质酶抑菌活性显著高于单独表达的几丁质酶活性。4.本研究还同时选取了几种有机化学农药对核盘菌和玉米大斑病菌的抑菌活性的测定及对玉米大斑孢子的萌发抑制效果的研究，结果表明，氟环唑对核盘菌对抑制效果最好，氟硅唑对玉米大斑病的抑制效果最好，咪鲜胺对玉米大斑病菌孢子的抑制效果最好。而且咪鲜胺对两种病原菌都有很好的抑制效

5、果。由此可知咪鲜胺是一种很好的广谱性杀菌剂。对以后的农业生产很有指导作用。本研究首次将球孢白僵菌和蜡蚧轮枝菌在大肠杆菌BL21中融合表达，增强了它们的抑制活性，减少了多次性发酵成本。初步探索了两种真菌几丁质酶基因融合表达蛋白，具有抑制玉米大斑病菌和核盘菌的活性，为融合蛋白的抑制病虫害方法的研究提供了理论基础，并且还研究化学农药对玉米大斑病和核盘菌的抑菌活性，来比较生物农药和化学农药的效果，为生物农药的发展提供了有新的材料和思路。关键词：虫生真菌，几丁质酶基因，融合蛋白，生物测定IIAbstractResearchoncloning,exp

6、ressionandbioactivityanalysisofthechitinasegenesfromentomogenousfungiSincemicrobialpesticideshavetheadvantageofamplerawmaterials,specificprevention,lessresistantamongtreatmentobjectsandenvironmentfriendly,theyhavebecomeapillarindustryofthebiologicalcontrol.TheBeauveriabas

7、sianafungusandVerticilliumlecaniiisthemostwidelyusedandthemoststudyofinsectpathogenicmicroorganisms.Chitinaseisthemaininsecticidalactivesubstances.Butsomepathogenicfungalcellwallsalsocontainchitin,sothesetwokindsofpathogenicmicroorganismchitinasealsoinhibitedonpathogenicf

8、ungi.CloningofchitinasegenefromBeauveriabassianaandVerticlliumlecanii,theseproteinswereexpressed