ngal噬菌体单链抗体的筛选、表达及其在免疫胶体金检测方法中的初步应用

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1、来兩硕壬学位论文ＮＧＡＬ嗟菌体单链抗体的筛选、表达及其在免疫胶体金检测方法中的初步应用专业名称：牛物医学工稱研究生姓名：许行尚导师姓名：何农跃教授苏恩本教授本工作得到国家义滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治＂＂十＂科技重大专项二五计划（２０１３ＺＸ１０００４１０３００２）、国家８６３计划（２０１２ＡＡ０２２７（Ｂ）和国《自然科学基金（６１２７１０５６）资助。－ＣＨＡＩＮＮＧＡＬＰＨＡＧＥＳＩＮＧＬＥＡＮＴＩＢＯＤＹＳＣＲＥＥＮＩＮＧＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＡＮＤ

2、ＩＴＳ，ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＩＮＩＭＭＵＮＥＣＯＬＬＯＩＤＡＬＧＯＬＤＴＥＳＴＭＥＴＨＯＤＡＴｈｅｓｉｓＳｕｂｍｉｔｅｄ化ＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＦｏｒｔｈｅＡｃａｄｅｍｉｃＤｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＢＹＸＵ－ＸｉｎｇｓｈａｎｇＳｕｅｒｖｉｓｅｄｂｐｙ－Ｐｒｏｆ．ＨＥＮｏｎｇｙｕｅＳＵ－ＥｎｂｅｎＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｍ

3、ｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＳｏｕｔｈｅａｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＡｒｉｌ２０１５ｐ东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加糾示注巧致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明’并表示了谢意。＇研究生签名：）碱日期：东南大学学位论文

4、使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的，可Ｗ采用影印复印件和电子文档、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允，可。除在保密期内的保密论文外许论文被查阅和借阅Ｗ公布（包括刊登）论文的全部或部分內容。论文的公布（包括刊登）授权东南大学研究生院办理。研究生签名：导师签名：ｍ要摘要ｎｅｕｒｅａ－ＮＧＡＬ人中性粒细施明胶酶相关脂质运载蛋白（ｔｏｐｈｉｌｇｌｔｉｎａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｌｉｐｏｃ址ｎ

5、，）与炎症、胚胎发育、免疫应答、趋化作用、信号转导Ｗ及多种肿瘤的发生与发展等过程密切相关，是新的早期肾损伤生化标志物。本研究旨在应用嚼茜体展示技术筛选ＮＧＡＬ特异性抗体，并建立免疫胶体金检测技术，为体肉ＮＧＡＬ变化水平的检测提供方法，为急性肾损伤的诊断提供帮助。本论文采用免疫的Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，从其脾脏中提取总ＲＮＡ，Ｗ反转录的ｃＤＮＡ为模板，通过设计的简并引物来扩増轻链可变区（ＶＬ）和重链可变区（ＶＨ），经过重叠延伸ＰＣＲ方法连接为单链抗体基因（ｓｃＦｖ）。经ｓｆｉｌ、Ｘｂａｌ双

6、酶切后连接到隨菌体载体ｐＣａｎｔａｂＳＥ中，转化大ｘ７肠杆菌ＴＧ１成功构建了库容为５ｌ〇ｐｆｉｊ的鼠源随菌体抗体库。经过ＰＣＲ检测，抗体库的插入率为８５％。随机挑取部分单克隆测序分析发现抗体重链和捏链可变区序列均不相同，说明了本研究构建的鼠源幢菌体抗体库多样性较好。Ｗ重组蛋白ＮＧＡＬ作为铅蛋白对隨菌体抗体库进行了四轮富集，从第困轮筛选后的抗性平板上挑取了３０个单克隆进行了唆菌体抗体ＥＬＩＳＡ鉴定，将阳性克隆构建ＣＨＯ细胞表达载体，转染到ＣＨＯ细胞中并进行压力筛选、重组表达，对表达纯化后的

7、抗体进行了姐Ｓ－ＰＡ紐ＥＵＡ、Ｓ效价及亲和力分析。结果表明，单克隆有１１个为强阳性。ＥＵＳＡ测定７－９抗体效价为１：１〇，抗体亲和力为６．５３２ｘｌ〇Ｍ。表明本论文成功获得了ＮＧＡＬ基因工程抗ＮＧＡＬ体，为检测诊断方法的建立提供了物质基础。应用重组表达的抗体与实验室制备的多抗，建立了ＮＧＡＬ免疫胶体金检测方法。确定了免疫胶体金层析方法最优条件金标抗体标记量１２ｉｍ：ｊｇ／Ｌ，金标抗体的稳定剂为０．０８％的阳任２００００，金２０ｍＭ８．２０．０１ＮＮ８标抗体的保存液为阳娜酸缓冲液巧

8、％ａｚｓ、０．０％－？６６２００００２０＼１－－；结合垫处理液为１１１口１１９．０扣５１？：１０．５４０、０．５％时１）（含％口＼／？〇１、样品）０＂．０１ｍｏＬＡ、０垫处理液为ｌ／７．４ＩＢＳ含１％ＢＳ．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、金０ｐＨ（）标抗体喷涂量为．５ｎＬ／ｍＬ、羊抗ＮＧＡＬ抗体喷涂量为１．２ｊｉｇ／ｍＬ、羊抗人的ＩｇＧ喷涂量为４＾ｌｇ