phev感染对树突状细胞的活化及其细胞疫苗免疫保护作用

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1、PHEV感染对树突状细胞的活化及其细胞疫苗免疫保护作用Studyonimmuneeffectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirus作者姓名：赵家宽专业名称：基础兽医学指导教师：贺文琦教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月6日中文摘要PHEV感染对树突状细胞的活化及其细胞疫苗免疫保护作用猪血凝性脑脊髓炎病毒（Porcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus

2、，PHEV）属于β冠状病毒属成员，其主要侵害3周龄以内的仔猪，临床上常常表现为两种类型，即呕吐、衰竭或/和明显的神经症状，死亡率20%～100%。临床上，PHEV多呈隐性感染，在猪群中不易察觉。尽管成年猪能够较好的抵抗PHEV，但感染后会出现消瘦和发育不良等症状，且易于继发其他病原的混合感染。目前，PHEV已在世界范围内广泛传播，本课题组调查结果显示，我国吉林、辽宁、山东等省份的猪群中PHEV感染率均为50%左右。研究表明，PHEV感染小鼠后通过神经传播，由于其发病急，机体的获得性免疫应答并未完全启动，感染

3、小鼠即已死亡，死亡率几乎为100%。但在该病毒感染初期是否能被机体的免疫细胞所识别，目前还不清楚。树突状细胞（Dendriticcells，DC）是目前已知的处理呈递抗原能力最强的抗原提呈细胞（Antigenpresentingcells，APCs）。对其他多种病毒感染的研究资料证实，DC能够识别并呈递病毒蛋白，分泌Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子，以激活机体免疫系统清除并杀伤病毒感染细胞。但PHEV能否刺激DC活化，并且活化的DC对机体有无保护力未曾研究。为了解PHEV刺激对DC活化的影响，以及DC在PHEV感染

4、过程中参与免疫应答的能力，本研究首先分离了Balbc小鼠骨髓细胞，并通过条件培养基诱导培养8天，获得纯度约77.69%的DC。将PHEV接种DC后，观察到细胞体积变大、产生大量突起、贴壁能力强，说明细胞成熟、吞噬及黏附能力增强。PHEV刺激DC后可分泌大量的炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-12等，其中IL-1β在24h分泌量达到对照组的12倍；TNF-α持续高水平分泌，约为800～1000pg/mL，为对照组的16倍，差异极显著；表明DC的免疫调节能力处于较高水平。FACS检测到DC

5、的CD40、CD86、MHCⅡ等表达也均上调25%左右，说明DC呈递抗原、刺激活化T细胞的能力增强。qPCR和WesternBlotting结果证明NFκB和炎性复合体通路活化；但IFN-α、β的表达被抑制，24h和48h的表达量不到对照组的10%，TLR7的表达也同样被抑制。上述研究结果说明PHEV在体外能有效的活化DC并促使其成熟为有效的抗原提呈细胞，具有潜在的激活淋巴细胞反应的能力，为机体提供有效免疫保护。但被激活的DC并不能通过Ⅰ型干扰素途径达到抗病毒反应。为了确定活化、成熟的DC对小鼠是否具有免疫

6、保护作用，以负载PHEV的DC作为细胞疫苗免疫小鼠，检测到免疫小鼠血清中的细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ上调1倍以上；血清PHEV抗体均呈阳性，说明小鼠体液免疫系统被激活。FACS分析免疫小鼠的脾脏细胞发现，无论是负载灭活病毒还是活病毒的DC疫苗经过两次免疫后，CD4/CD8均比第一次免疫后高接近1倍，IFN-γ分泌T细胞数量是对照组的1.5倍，说明小鼠的细胞免疫系统也同时被活化。I两次加强免疫后，滴鼻接种致死剂量的PHEV，14天内负载PHEV的DC组死亡率为25%，而负载灭活PHEV的DC组死

7、亡率仅为20%，对照组则几乎为100%，说明负载病毒的DC能够为小鼠提供一定的免疫保护力抵抗PHEV感染。由此可见，PHEV能够激活DC，促使其成熟、活化，表面蛋白表达，细胞因子分泌及NFκB和炎性复合体通路信号激活；负载病毒的DC疫苗能够在一定程度上对小鼠提供免疫保护力。这些研究成果不仅为DC参与PHEV感染过程中的免疫应答机制奠定基础，而且也为开发DC细胞疫苗抵抗PHEV感染提供了重要的参考依据。关键词：猪血凝性脑脊髓炎病毒；树突状细胞；激活；疫苗；免疫保护IIAbstractStudyonimmune

8、effectofdendriticcellsactivatedbyporcinehemagglutinationencephalomyelitisvirusPorcinehemagglutinatingencephalomyelitisvirus(PHEV)belongingtobetacoronavirusisasingle-strandRNAviruses.PHEVcaninfectabout1~3week-