α-葡萄糖苷酶活性检测及抑制剂筛选新方法研究

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1、中图分类号：单位代号：10280密级：学号：12721997硕士学位论文SHANGHAIUNIVERSITYMASTER’SDISSERTATION题α-葡萄糖苷酶活性检测及抑目制剂筛选新方法研究作者刘莹学科专业生物化学与分子生物学导师张娟完成日期2015年5月上海大学硕士学位论文上海大学本论文经答辩委员会全体委员审查,确认符合上海大学硕士学位论文质量要求。答辩委员会签名：主任：委员：导师：答辩日期：I上海大学硕士学位论文原创性声明本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已发表或撰写过的研究成果。

2、参与同一工作的其他同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。签名：日期：本论文使用授权说明本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容。（保密的论文在解密后应遵守此规定）签名：导师签名：日期：II上海大学硕士学位论文上海大学生物化学与分子生物学硕士学位论文α-葡萄糖苷酶活性检测及抑制剂筛选新方法研究姓名：刘莹导师：张娟学科专业：生物化学与分子生物学上海大学生命科学学院2015年5月III上海大学硕士学位论文ADissertationSubmitt

3、edtoShanghaiUniversityfortheDegreeofMasterinBiochemistryandMolecularBiologyStudyofNewMethodsforα-GlucosidaseActivityAssayandItsInhibitorsScreeningM.D.Candidate：YingLiuSupervisor：JuanZhangMajor：BiochemistryandMolecularBiologySchoolofLifeSciences,ShanghaiUniversityMay,2015IV上海大学硕士学位论文摘要I

4、I型糖尿病是一种非胰岛素依赖型的糖尿病，持续性的高血糖是其诊断的依据，通过控制血糖水平可以有效防止糖尿病的恶化。α-葡萄糖苷酶分布于小肠刷状缘膜上皮细胞上，是水解碳水化合物的关键酶，它能从低聚糖类底物的非还原端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖，葡萄糖经小肠吸收进入血液，导致血糖水平的上升，故抑制α-葡萄糖苷酶的活性能够延缓碳水化合物的消化，减缓葡萄糖的吸收，抑制餐后高血糖。因此，测定α-葡萄糖苷酶的活性，从天然或合成化合物中快速准确筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂将具有重要意义。然而当前α-葡萄糖苷酶抑制剂的体外分子水平筛选方法存在准确度不高的缺点，而动物水平的方法所需时

5、间长，无法满足快速准确筛选的要求。本论文针对现有检测方法的不足，从硼酸衍生物对糖类分子的特异性识别角度出发，分别从体外分子水平和细胞水平构建了两种检测α-葡萄糖苷酶活性及抑制剂的生物传感器。具体内容如下：1、一种简单可视的检测α-葡萄糖苷酶活性及其抑制剂筛选的光谱方法针对当前α-葡萄糖苷酶抑制剂体外分子水平筛选方法酶-底物法在筛选具有共轭结构的分子时可能出现假阳性的缺陷，在本论文部分工作中，我们利用金纳米颗粒（AuNPs）优良的光学性质，通过苯二硼酸（PDBA）对α-葡萄糖苷酶底物的特异性识别，构建了一种检测α-葡萄糖苷酶活性及其抑制剂筛选的光谱学法。该方法的建立是

6、基于1,4-苯二硼酸对底物4-氨基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（pAPG）中2位和4位顺式邻二羟基的特异性识别，这种识别将诱发pAPG功能化金纳米颗粒（AuNPs）的聚集，导致溶液颜色的变化。作为α-葡萄糖苷酶的底物，pAPG能够被水解为4-氨基苯酚（pAP）。与底物pAPG不同，水解产物pAP因不含有顺式邻二羟基基团无法被PBDA识别，无法引起AuNPs的聚集和相应的颜色变化，由此可检测α-葡萄糖苷酶的活性。在最优化的实验条件下，650nm处的吸光度与520nm处吸光度的比值与α-葡萄糖苷酶的活性呈现线性相关，其线性检测范围为0.05到1.1U/mL，最低检测限为0.

7、004U/mL。同时，我们进一步用所构建的方法评价了没食子酸和槲皮素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，测得两种物质的IC50值分别为1.16mM和1.82μM。该方法克服了当前常用光谱方法在紫外区测定酶活和筛选抑制剂的缺陷，具有宽的线性检测范围，低的检测限，高的准确V上海大学硕士学位论文度，在α-葡萄糖苷酶活性的检测及其抑制剂的筛选方面显示了良好的应用潜力。2、从体外分子水平和细胞水平上双重检测α-葡萄糖苷酶活性及其抑制剂的电化学方法针对当前α-葡萄糖苷酶抑制剂体外分子水平和细胞水平筛选方法准确度不高的问题，在本论文部分工作中，我们利用磁纳米颗粒（MNPs）/pAPG