家蚕自噬基因表达与bmcpv病毒感染模型的研究

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1、分类号：S884学校代码：10712UDC：591研究生学号：2011060166密级：公开2015届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文家蚕自噬基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究学科专业：特种经济动物饲养研究方向：蚕桑病理与病原微生物研究生杨晓冰指导教师：钱永华教授焦锋副教授完成时间：2015年5月中国陕西杨凌Classificationcode:S884_Universitycode:10712UDC:591Postgraduatenumber:2011060166Confidentialitylev

2、el:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2015Autophagy-relatedGeneExpressioninSilkworm(Bombyxmori)andBmCPVInfectionModelMajor:EconomicAnimalsResearchfield:PathologyandPathogenicMicroorganismsinSericultureNameofPostgraduate:YangXiaobingAd

3、viser:QianYonghuaCo-adviser:JiaoFengDateofsubmitted:2015-5YanglingShaanxiChina家蚕自噬相关基因表达与BmCPV病毒感染模型的研究摘要作为机体的一种防御和应激调控机制，细胞自噬具有清除细胞内失去功能的各种生物大分子如变性蛋白质、核酸及其他细胞成分的功能，以维持细胞的平衡状态，有利于细胞的存活，所以不管是在不同的物种间、还是在各种类型的细胞之间，自噬机制都普遍被保留下来，在进化上表现出高度的保守性。最近的研究显示自噬也参与了天然免疫应

4、答与适应性免疫应答，在生物体应对环境应激上具有重要作用，可防止某些疾病如肿瘤、肌病等，此外，自噬机制还参与了抵御病原微生物感染的过程。家蚕属于鳞翅目昆虫，因具有变态发育特征而被自噬研究者重视，在变态发育时期，大量的家蚕幼虫组织被自噬体和其他一些蛋白水解酶降解，再由机体合成新的成虫组织和器官。本试验首先在基因转录水平及蛋白质翻译水平分析了家蚕主要自噬相关基因的表达规律。由于自噬作用在家蚕病理上的研究尚未见报道，因此本试验采用家蚕质型多角体病毒(BombyxmoriCytoplasmicPolyhedrosis

5、Virus,BmCPV)感染家蚕，分析了自噬相关基因表达与病毒感染的关系，获得的主要结果如下：1、通过qRT-PCR方法，检测了3个自噬相关基因BmAtg8、BmAtg5、BmAtg7在家蚕不同组织中的表达模式，3个BmAtg基因在丝腺组织的相对表达水平最高，其次是脂肪体和中肠，在马氏管、肌肉和皮肤中相对表达水平较低。2、通过基因克隆的方法，构建了pET32a载体与BmAtg8基因的重组质粒。通过免疫新西兰大白兔获得了BmATG8蛋白的多克隆抗血清，使用WesternBlot方法检测了家蚕内源BmATG8和

6、BmATG8-PE的表达。发现BmATG8和BmATG8-PE蛋白条带分别位于14kDa、12kDa的位置，并且该蛋白在家蚕不同组织中的表达模式与实时定量检测结果一致。在5龄家蚕第1-8天的丝腺组织中，BmATG8-PE/BmATG8比值出现显著的变化。3、构建了基于BmATG8蛋白氨基酸序列的系统进化树，发现BmATG8蛋白与其他物种相关蛋白的遗传距离较近，显示出自噬机制的进化保守特征。4、使用qRT-PCR技术和免疫印迹方法检测了5龄第2天家蚕中肠细胞在饥饿、雷帕霉素处理、高温和低温冲击1h条件下的3个

7、BmAtg基因表达及BmATG8蛋白表达。发现BmAtg8基因在饥饿处理后24h表达显著上升，WB条带也显示了BmATG8蛋白表达增加的同步性；雷帕霉素处理后未发现3个BmAtg基因及BmATG8蛋白表达的显著变化；37°C高温处理1h后BmATG8的转化效率显著下降，而4°C低温冲击1h未见家蚕BmAtg基因及蛋白的显著变化。5、分析了BmCPV感染后家蚕的典型病症，使用RT-PCR技术检测了病毒RDRP基因在整个病程中的增殖规律。多角体被食下后24h可检测到RDRP基因，在感染72h后该基因大量表达。使

8、用苏木精-伊红染色方法(HE)观察了CPV病毒感染后的中肠石蜡切片，发现感染72h时有大量病毒多角体形成，此后多角体逐渐增多，柱状细胞出现严重的核浓缩和细胞破裂，家蚕中肠基因组DNA的降解出现在病毒感染后120h。6、使用免疫组化技术证实家蚕内源BmATG8/BmATG8PE蛋白广泛分布在细胞质中，使用透射电子显微镜观察到了家蚕中肠组织内的典型自噬体，呈现双层膜或多层膜结构。7、检测了CPV病毒感染家蚕后中肠自噬