河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁

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AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI全日制硕士专业学位（毕业）论文河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁学位申请人：陈晓洁指导教师：徐继忠教授李中勇副教授学位名称：农业推广硕士研究领域：园艺授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月八日 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意》学位论文作者签名咏&签字日期：>0化年6月《曰关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定’有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘’允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：丨^导师签名：签字H期：年G月学位论文作荞毕业后去向:工作单位：电话:通讯地址：邮编: 分类号：S661.1单位代码：10086密级：公开学号：20139110628河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁InvestigationsontheOccurrenceofBotryosphaeriaCankerofAppleinHebeiProvinceandStudyonRapidMicropropagationTechniquebyShootTipCultureofRingRot-resistantAppleRootstock学位申请人：陈晓洁指导教师：徐继忠教授李中勇副教授学科专业：园艺学位类别：农业推广硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月八日 摘要轮纹病是我国苹果三大病害之一，易造成树体衰弱、采前采后烂果等问题，已成为影响我国苹果优质高效生产的关键问题之一。本研究通过河北省苹果主产区苹果枝干轮纹病发展现状的调查和枝干轮纹病的药剂防治试验，提出了苹果枝干轮纹病的防治建议，并研究了2种抗轮纹病苹果砧木的组培快繁技术，建立了快繁体系，为抗性砧木的利用提供了材料。主要研究结果如下：1．2014年春季和夏季,对河北省苹果主产区中66个果园苹果枝干轮纹病发生和防治情况进行了调查。调查结果显示：河北省苹果枝干轮纹病普遍发生且病情严重，总体发病率达76.26%，病情指数为63.70；不同地区苹果枝干轮纹病发生存在差异，承德和张家口地区发病较轻，其次为保定，而唐山、石家庄、邢台和衡水四个地区受害严重，发病率均达到80%以上，病情指数均高于70；随树龄的增大，苹果枝干轮纹病发病率和病情指数提高：0~5年生幼树发病较轻，发病率44.71%，病情指数33.55；而16年以上果树，发病率高达100%，病情指数为98.53；不同品种苹果枝干轮纹病发生情况不同，红星、富士和王林发病最严重，其次是嘎啦和斗南，国光发病最轻；在枝干轮纹病的化学防治中常用的药剂有多菌灵、石硫合剂和戊唑醇等。2.采用菌丝生长速率法在室内测定了6种药剂对苹果轮纹病病原菌菌丝生长的抑制效果，并测定了各药剂的田间防治效果。菌清、树安康、腐愈灵、波尔多液、戊唑醇和甲基硫菌灵6种药剂对苹果轮纹病病原菌菌丝生长的抑制效果均达到90%以上，其中戊唑醇、波尔多浆和腐愈灵的抑菌效果最佳，前两者抑制效果达100%，后者为99.71%。田间防治效果与室内抑菌力测定结果基本一致，且刮除病斑后进行施药处理防治效果优于直接施药处理，除甲基硫菌灵外各药剂在刮除病斑后的防治效果均达到90%以上，波尔多浆、戊唑醇和腐愈灵的田间防治效果最高，防效高于97%。3.1-1-10-8砧木外植体材料经升汞浸泡处理10min的消毒效果最好，外植体成活率较高，为65%；以MS为基本培养基，添加蔗糖35g/L、琼脂6.2g/L，适宜1-1-10-8砧木启动培养的植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L；适宜增殖培养的植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.075mg/L，增殖系数可达到每4周12.71倍；以1/2MS为基本培养基，附加蔗糖15g/L、琼脂6g/L，适宜组培苗生根的植物生长调节剂配比为IAA1.0mg/L+IBA0.6mg/L，生根率达98.06%，每株苗平均生根7.89条，移栽成活率达92.38%。以MS为基本培养基，附加蔗糖35g/L、琼脂6.2mg/L，适宜J35-8砧木外植体 启动培养的植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L；适宜增殖培养的植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L，增殖系数可达到每4周8.5倍；以1/2MS为基本培养基，附加蔗糖15g/L、琼脂6g/L，适宜组培苗生根的植物生长调节剂配比为IAA1.0mg/L+IBA0.3mg/L，生根率达90%以上，每株苗平均生根9.35条，移栽成活率达100%。关键词：苹果；枝干轮纹病；抑菌力；抗轮纹病砧木；组培快繁； InvestigationsontheOccurrenceofBotryosphaeriaCankerofAppleinHebeiProvinceandStudyonRapidMicropropagationTechniquebyShootTipCultureofRingRot-resistantAppleRootstockAuthor:ChenXiaojieMajor:HorticultureSupervisor:Prof.XuJizhongA.P.LiZhongyongAbstractAppleringrotisoneofthethreemajordiseasesofappleinChina,whichcausedgrowthweakoftrees,andleadedtonumerousrottenfruitsbeforeandafterharvest.Thisdeseasehadbecamethemostseriousproblemofrestrictioninappleproduction.Inthisresearch,WehavemadeasuggestionabouttheproblemofcontrolofBotryosphaeriacankeronapplebranchthroughtheresultsofInvestigationsontheoccurrenceofBotryosphaeriacankerofappleinHebeiprovinceandthechemicalcontrolexperiments.Thematerialsfortheapplicationofresistantrootstockwereprovidedbyresearchingonrapidmicropropagationtechniquebyshoottipcultureoftworingrot-resistantapplerootstock.Themainresultswereasfollows:1Duringspringandsummerin2014,theoccurrenceandcontrolstatusofBotryosphaeriacankerofapplewereinvestigatedin66orchardswhichlocatedinmajorappleproductionareasinHebeiprovince.Theresultsshowedthattheincidenceofthisdiseaseingeneralwasabout76.26%,diseaseindexwas63.70.Theoccurrenceofthediseasevariedamongdifferentregions.Comparatively,theoccurrenceofthediseasewasmoresevereinTangshan,XingtaiandShijiazhuangthanthatinZhangjiakouandChengde.Theolderthetree,themoreseverethedisease.Theincidencesandthediseaseindexwere44.71%and33.55,100%and98.53forthetreesattheageof0-5andmorethan16,respectively.Thereweresignificantdifferencesinoccurrenceofthediseasewasobservedamongthemaincultivars.AmongthechemicalsusedtopreventBotryosphaeriacankerofapple,carbendazim,limesulphurandtebuconazolewerethemostpopularfungicides.2TheInhibitioneffectofsixfungicidesonBotryosphaeriadothideawastestedbymeasuringmyceliumgrowthrate,andthecurativeeffectsweretested.Theresultshowedthat，whenthefungicideswereappliedwithrecommendeddosagebymanufacturers，theinhibitiveefficiencyofthesixfungicidesweremorethan90%,bordeauxpaste, tebuconazoleandhealingagenthadthebestinhibitiontothegrowthofBotryosphaeriadothidea,theinhibitiveefficiencyofthethreefungicideswere100%,100%and99.71%,respectively,Theresultsofcurativeeffectsandinhibitioneffectsonmyceliumgrowthwereconsistent.Thecurativeeffectswerebetterafterscrapingthelesions,andthecurativeeffectsofthesefungicides,exceptthiophanate-methyl,weremorethan90%,bordeauxpaste,tebuconazoleandhealingagenthadthebestcontrolefficiencywhichweremorethan97%.3Takingtheshoottipsoftheringrotresistantapplerootstock1-1-10-8asmaterials,theresultsshowedthatthesterilizationtimeofshoottipusing0.1%HgCl2was10minutes,andthebasicmediumwasMSsupplementedwithsugar35g/Landagar6.2g/L,theoptimalplantgrowthregulatorsofstartculturemediumthatsuitedmultiplicationwere6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L.Theoptimalplantgrowthregulatorsinsubculturemediumwere6-BA1.0mg/L+NAA0.075mg/L,andthecoefficientofmultiplicationwereexceeded12.71timesineveryfourweeks.TheoptimalplantgrowthregulatorsforrootingwereIAA1.0mg/L+IBA0.6mg/L,therootingratesofshootswere98.06%,theaveragenumberofrootingwas7.89.Thentherootedplantletsweretransplanted,thesurvivalrateswere92.38%.TheresultsshowedthattakingtheshoottipsoftheringrotresistantapplerootstockJ35-8asmaterials,thebasicmediumwasMSsupplementedwithsugar35g/Landagar6.2g/L,theoptimalplantgrowthregulatorsofstartculturemediumthatsuitedmultiplicationwere6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L.Theoptimalplantgrowthregulatorsinsubculturemediumwere6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L,andthecoefficientofmultiplicationwereexceeded8.5timeseveryfourweeks.TheoptimalplantgrowthregulatorsforrootingwereIAA1.0mg/L+IBA0.3mg/L,therootingratesofshootsweremorethan90%,theaveragenumberofrootingwas9.6.Thentherootedplantletsweretransplanted,thesurvivalrateswere100%.Keywords:Apple;BotryosphaeriaCankerofApple;CurativeEffects;Ringrot-resistantAppleRootstock;RapidMicropropagation 目录1引言................................................................................................................................................11.1研究进展............................................................................................................................11.1.1苹果枝干轮纹病的发生状况和调查方法.............................................................11.1.2影响苹果枝干轮纹病发生的因素.........................................................................21.1.3苹果枝干轮纹病的防治.........................................................................................41.1.4砧木的组培快繁.....................................................................................................51.2选题依据和目的意义........................................................................................................82材料与方法..................................................................................................................................102.1河北省苹果枝干轮纹病的发生.......................................................................................102.1.1试验地点..............................................................................................................102.1.2试验时间..............................................................................................................102.1.3试验方法..............................................................................................................102.1.4数据处理与分析..................................................................................................102.2苹果枝干轮纹病的防治...................................................................................................112.2.1不同杀菌剂对轮纹病菌室内抑菌力的测定.......................................................112.2.2几种药剂对苹果枝干轮纹病田间防治效果.......................................................122.32种抗轮纹病苹果砧木的组培快繁.............................................................................132.3.1试验材料..............................................................................................................132.3.2试验方法..............................................................................................................133结果与分析..................................................................................................................................153.1河北省苹果枝干轮纹病的发生状况...............................................................................153.1.1不同地区苹果枝干轮纹病病情差异..................................................................153.1.2不同树龄苹果树枝干轮纹病病情差异..............................................................163.1.3不同品种苹果枝干轮纹病病情差异..................................................................173.2苹果枝干轮纹病的防治..................................................................................................193.2.1不同药剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果..............................................193.2.27种药剂处理对苹果枝干轮纹病的田间防治效果..........................................223.3抗轮纹病苹果砧木的组培快繁.......................................................................................243.3.1HgCl2消毒时间对外植体消毒效果的影响.......................................................243.3.2不同浓度6-BA处理对芽诱导成活的影响.......................................................243.3.3不同6-BA与NAA配比对组培苗继代增殖的影响.........................................253.3.4不同IAA与IBA配比对组培苗生根及移栽成活率的影响............................274讨论..............................................................................................................................................314.1河北省苹果枝干轮纹病发生状况...................................................................................314.2苹果枝干轮纹病的防治..................................................................................................32 4.3抗轮纹病苹果砧木的茎尖培养快速繁殖体系的建立............................................335结论...............................................................................................................................................35参考文献..........................................................................................................................................36在读期间发表论文..........................................................................................................................40作者简历..........................................................................................................................................41致谢..............................................................................................................................................42 主要英文缩略词目表缩写符号英文名称中文名称MSMurashigeandSkoog(Medium)MS培养基6-BA6-Benzyladenine6-苄基腺嘌呤NAANaphthalene-aceticAcid萘乙酸IAAIndoleaceticacid吲哚乙酸IBAIndole-3-Butytricacid吲哚丁酸GA3GibberellinA3赤霉素PVPPolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮VcVitaminC抗坏血酸（维生素C）AcActivatedcarbon活性炭PDAPotatodextroseagarMedium马铃薯葡萄糖琼脂培基DPSDataProcessingSystemDPS数据处理工作平台gGram克mLMilliliter毫升 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁1引言苹果（MalusdomesticaBorkh.）属蔷薇科（Rosaceae），仁果亚科（Pomoideae），苹果属（MalusMill.），为温带多年生落叶果树，具有丰富的种质资源[1]。苹果果实富含多种人体必需的营养物质，口感佳，是人们生活中不可或缺的重要水果，做为世界四大水果（苹果、葡萄、柑橘、香蕉）之首，深受广大人民的喜爱。我国的苹果栽培历史已长达一百多年，是世界上苹果栽培面积最大和产量最高的国家。苹果产业在我国国民经济中占有重要的地位[2]，我国国家统计局农村社会经济调查司2012年统计结果显示，全国水果总产量为24056.84万吨，其中苹果产量为3849.07万吨，占全国水果总产量的16%；河北省是我国苹果主产省份之一，2012年河北省苹果栽培面积总计23.57万hm2，总产量为311.46万吨，面积和产量分别居全国的第4位和第5位[3]。我国是苹果生产大国，但不是生产强国，与奥地利、瑞士、法国和意大利等苹果生产技术发达的国家相比，我国苹果生产还面临着单产水平较低、果实品质不高等问题[1-2]，除落后的栽培模式外，苹果轮纹病的危害是造成这些问题的重要原因之一[3]。苹果轮纹病是由苹果轮纹病病原菌（Botryosphaeriadothidea）引起的真菌性病害，不仅影响果实的品质和产量，而且危害枝干，削弱树势，影响结果年限，甚至造成枯枝死树，造成较大的经济损失[4-5]。我国目前的苹果主栽品种如富士、红星等，虽然品质优良但易感轮纹病，随着其栽培面积不断扩大，苹果轮纹病的发生也越来越普遍，危害日趋严重。近年来，随着果实套袋技术的广泛推广应用，使苹果果实轮纹病得到了较好的控制，但枝干轮纹病的发生却呈现逐年上升的趋势[6-9]，引起了果树工作者的重视。1.1研究进展1.1.1苹果枝干轮纹病的发生状况和调查方法苹果枝干轮纹病在我国广泛发生，国家苹果产业体系病虫害防控研究室于2008年对全国7个主要苹果生产省市苹果园病虫害发生情况的调查结果显示，苹果枝干轮纹病的发病率已达80%以上，其危害遍及范围广于苹果腐烂病[9]。2009年国立耘等[5]调查了全国苹果枝干轮纹病发生和防治情况，发现山东和河南两个省苹果枝干轮纹病发病情况最为严重，发病率均达到100%，病情指数高达85以上；其次是北京地区，发病率为90.4%，病情指数为70.2；辽宁省、河北省和陕西省再次之，但1 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文发病情况仍然很严重，发病率为75%，病情指数为50以上。杨军玉、曹克强等[10]2011~2012年的统计分析发现全国除甘肃和黑龙江地区受苹果枝干轮纹病危害程度较轻外，其余各苹果生产区均严重发生枝干轮纹病。苹果枝干轮纹病发生状况的评价方法：通过调查树体病斑发病等级，计算得出苹果枝干轮纹病的发病率和病情指数这两项病害评价指标，对各地区苹果枝干轮纹病的发生状况进行正确评价。苹果枝干轮纹病病斑发病等级一般参照国立耘枝干轮纹病病害分级标准确定，共分为0~4级5个发病等级。0级：免疫，树体无轮纹病瘤分布；1级：树体分布有零星散生轮纹病瘤；2级：主干、骨干枝轮纹病瘤较为密集或有少量连片的轮纹病斑；3级：主干、骨干枝上有较多连片的轮纹病斑，主干病斑面积范围为主干面积20%以上；4级：主干、骨干枝上有大量连片的轮纹病斑，主干病斑面积范围为主干面积的60%以上。1.1.2影响苹果枝干轮纹病发生的因素苹果枝干轮纹病的发生与栽培品种的遗传特性有关，并且与树龄树势、果园地形地势、气候条件以及栽培管理水平等条件密切相关[11-12]。1.1.2.1品种不同苹果品种枝干轮纹病发生状况不同。轮纹病菌主要通过果树的皮孔侵入树体，不同品种的遗传特性不同，其枝条皮孔大小、密度和结构以及抗性相关酶的活性都有很大差异，对轮纹病菌的抗性和枝干轮纹病的敏感程度也明显不同[13-14]。富士、金冠和金晕等品种最易感染枝干轮纹病，其次为元帅，首红和国光等品种较抗病，津轻高抗苹果枝干轮纹病。国光一般情况下较抗枝干轮纹病，但若在多雨的年份或在栽培管理水平粗放的情况下，也可能出现感病的现象[15]。陈建中[16]等根据17个苹果品种（系）枝干轮纹病田间发病状况的调查以及田间和温室接种结果得出各品种对轮纹病菌的抗性鉴定结果，认为对苹果枝干轮纹病具有较强抗性的有秦冠、GS4354和北之幸3个品种（系），易感枝干轮纹病的品种有富士、华冠、金冠和红星等。1.1.2.2树龄不同树龄的果树苹果枝干轮纹病发生轻重程度不同。国立耘[5]2009年在中国各苹果主产区的调查结果表明，苹果枝干轮纹病的危害随着树龄的增大而逐年加重，发病率和病情指数均显著提高。我国4~10年生苹果树枝干轮纹病平均发病率为56.7%，病情指数为37.0；11~17年生的果树苹果枝干轮纹病发病率为78.7%，病情指数为53.8；18~24年生的苹果树枝干轮纹病发病率为91.5%，病情指数为70.8；2 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁25年生及以上的果树全部发生枝干轮纹病，病情指数高达95.3。苹果枝干轮纹病的危害随树龄的增高逐年加重，可能是由于树体和果园的郁闭度随着树龄的增长而增加且病害在树体逐年累积造成的。1.1.2.3气候条件气候条件是苹果枝干轮纹病发生和流行的重要影响因素，当气温高于20℃，相对湿度高于75%或连续降雨量达10mm以上时，有利于病菌的繁殖以及孢子的传播和侵入，造成病害严重发生[12,17]。风雨飞溅有助于轮纹病菌分生孢子的传播和扩散，影响轮纹病菌孢子释放的数量和时间最重要的因素是降雨量的大小和持续时间的长短，其中持续降雨的时间对病原菌孢子的释放起着决定性作用[18-19]。在河北省地区，7~8月份高温多雨，为苹果枝干轮纹病发病危害的高峰期。此外，温素卿[18]认为风力大小对轮纹病发生的轻重程度也有一定的影响，风力越大，分生孢子传播速度越快，阴雨大风天气的传播效果更明显。1.1.2.4地形不同地形条件对苹果枝干轮纹病的发生也具有重要的影响。梁魁景等[6]2010年对河北省苹果园病虫害发生的调查中发现，苹果枝干轮纹病在不同地势地貌的果园中发生和危害的轻重程度不同，山地果园受枝干轮纹病的危害程度明显较平原果园低，山地果园枝干轮纹病发病率为65%，而平原果园发病率则高达84%。可能是由于山地果园背风向阳，通透性好，空气湿度小，而且不易大量积水，而不利于轮纹病菌的传播和繁殖的原因。1.1.2.5栽培管理水平轮纹病菌为弱寄生菌，凡是由于管理粗放或管理措施不当，如土肥水管理不合理、整形修剪措施不当和树体负载量过高等，而导致树势衰弱的，都可能诱发苹果枝干轮纹病。据调查[19-20]，盛果期果园主枝着生部位高、枝量大、通风透光性良好的果园苹果枝干轮纹病发病率低；相反，整形修剪措施不当，树体通风透光条件差的果园枝干轮纹病发病率相对较高。树体负载量过高，容易引起果树“大小年”现象，降低树势和树体对病原菌的抵御能力。连续不规范的使用环剥、环割以及施用多效唑等重创性促花技术措施，会造成树体伤痕累累，加之土肥水管理条件较差，导致树势衰弱，枝干轮纹病严重发生。据张新志[21]调查，连续4年在5月和7月对主干和侧枝进行两次环剥的果树树冠外围新梢平均长度较短，枝干轮纹病病株率高达92%，而连续4年严格规范进行环剥的果树，外围新梢长度长，枝干轮纹病发病率只有15%。3 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文1.1.3苹果枝干轮纹病的防治1.1.3.1农业防治选用抗性品种和抗性砧木是作物病害的重要农业防治措施之一[22-24]。生产上可选用对苹果轮纹病免疫的栽培品种鸡冠，抗性较高的品种秦冠、北之幸等，中抗品种斗南等预防苹果枝干轮纹病的发生。砧木对品种的抗性有重要影响，生产上常选用抗性砧木来防治植物病害。邓建平[22]选用了三种砧木的扦插苗嫁接红地球葡萄，发现以刺葡萄和华佳8号为砧木嫁接红地球葡萄可以增强红地球葡萄接穗对黑痘病抗性，嫁接于这两种砧木上的红地球葡萄对黑痘病感染率和严重程度均显著低于以巨峰为砧木的红地球葡萄植株。杨华等[23]发现，以刺茄和番茄为砧木嫁接茄子苗，其黄萎病和疫霉病的发病率都降低了80%以上。姜中武等[24]将高感轮纹病的富士苹果嫁接于中间砧“烟砧一号”上，发现富士品种的果实轮纹病和枝干轮纹病的发病率都显著降低。而且还可以显著提高富士品种果实可溶性固形物的含量，提高果实的内在品质。刘志[17]根据田间自然发病情况的调查和分级，鉴定出GM256、扎矮76、134-10和MM106这4种苹果砧木高抗枝干轮纹病，病情指数仅为11.11~15.00；M26、山定子、马克9、GM349、圆叶海棠、GM310、辽砧2号等中抗枝干轮纹，病情指数为27.94~47.50；M7和M9为高感苹果砧木，病情指数高于80。加强苗木病害防治，培育无病壮苗，提高新建果园质量是果园长远安全发展的基础工作。要选择无病区建园，保证选用的苗木、接穗和接芽等材料安全、不带病。并且注意不与桃树、核桃等混栽，果园周围避免栽植轮纹病菌的寄主植物，如杨树和白桦等[22]。加强栽培管理、增强树势、提高树体抗病能力是生产中重要的农业防病措施。注意合理修剪、合理的花果管理和合理的施肥灌水方式，要加强氮、磷、钾配合施用，不偏施氮肥[27]，实行有机平衡施肥，以增强树势。搞好果园卫生也很重要，要及时刮除病斑、病瘤，剪除病枝，注意将病残体彻底清理出果园，可进行深埋处理或集中烧毁。1.1.3.2、化学防治目前生产上常采用刮树皮结合施用化学药剂的方式防治果树轮纹病，市场上用于防治该病的化学杀菌剂种类很多，如三唑类、取代苯类等，其中戊唑醇、甲基硫菌灵、多菌灵、苯醚甲环唑等，均对苹果枝干轮纹病具有较好的防治效果[27-30]。周增强等[30]测定了几种化学杀菌剂对苹果轮纹病的田间防治效果，认为戊唑醇对苹果轮纹病具有较好的防治效果，其防效与多菌灵相当，并显著高于代森锰锌，而且与4 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁代森锰锌配合使用时有更好的防治效果。郭云忠等[31]测定了不同农药品种对苹果轮纹病菌的控制效果，认为戊唑醇和甲基硫菌灵等化学杀菌剂对轮纹病菌具有较高的毒力。但已有研究表明轮纹病菌已对有些化学杀菌剂产生了不同程度的抗药性。王英姿[32]等测试了山东省苹果轮纹病菌对戊唑醇的抗药性，发现已有15.49%的测定菌株对戊唑醇产生2~5倍的低水平抗药性。苏平、周增强等[33]发现山东、辽宁和河南省的苹果轮纹病菌对戊唑醇的敏感性有较大差异。周增强、国立耘等[34]对中国苹果主产区4省27个县市苹果轮纹病菌对几种化学杀菌剂的敏感性的调查中发现田间已存在对多菌灵和丙环唑的敏感性都相对较低的菌株。说明有些常规杀菌剂对苹果轮纹病的防治具有一定的风险性，应及早引起重视，所以新药剂的研制和筛选工作显得至关重要。调查发现不少果园仍然在违规使用无公害果园生产中禁用的福美胂来防治病害[35]，不仅严重污染生态环境，而且会增加农产品中有毒化学物质的残留量，对人类健康带来潜在危害，同时也容易诱导病原菌产生抗药性[36]。所以，还需要继续重视防治枝干轮纹病的有效药剂的研制开发和筛选工作。1.1.3.3、生物防治随着人们对食品安全和环境保护[34]意识的增强，寻找和开发安全高效的病害防治方法也引起了人们的重视，生物防治是安全防治病害的重要方式之一。微生物农药对人类和环境有较好的安全性，备受人们欢迎。国内已有利用拮抗细菌防治苹果轮纹病以及木霉真菌防治梨轮纹病的有关报道[36-41]。杨华等[42]筛选的拮抗细菌No.1和展丽然等[40]获得的生防放线菌等均能对苹果轮纹病菌起到拮抗作用。赵白鸽等[37]从苹果树皮上分离得到一种光谱拮抗菌株—枯草芽孢杆菌B-903，其对离体的和侵入果实的轮纹病菌都有明显的抑制效果；纪兆林等[39]从土壤中分离得到地衣芽孢杆菌W10，菌株代谢的分子量为46049.2Da的抗菌糖蛋白20倍液可100%抑制轮纹病菌的产孢和分生孢子的萌发。此外还有603菌株、I32菌株等[43-45]，其防病机理均为利用生防微生物产生抗菌蛋白，对病原菌产生抑制作用。1.1.4砧木的组培快繁自根砧木苗的无性繁殖方式主要有扦插繁殖、压条繁殖和组织培养等[46]。与扦插和压条这两种繁殖苗木的方式相比，利用组织培养技术繁育自根苗可以在室内进行且环境条件可控，可以不受土地和季节的限制，其繁殖系数高，繁殖周期短，可在短时间内获得大量整齐一致的砧木组培苗，还能获得无毒苗木，是高效率繁殖优质苗木的最佳方式[47]。5 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文1.1.4.1植物生长调节剂的应用在植物组织培养过程中，不同的外植体材料在不同培养基上的反应有很大差异，同一品种的外植体材料在不同培养基上生长分化状态不同，不同品种的外植体材料在同一培养条件下的表现都有所不同[48]，培养基激素的种类和浓度配比是影响组培苗生长增殖和生根的重要因素之一[49-52]。在离体的茎尖顶端分生组织中，不能自给生长激素,必须在培养基中提供适宜质量浓度的生长素与细胞分裂素以促进茎尖的生长和分化[53]，植物激素的种类、质量浓度和配比是影响外植体材料诱导成活、快速繁殖、正常生长发育和生根的关键，在组织培养中应着重考虑[52,54-57]。邵开基[58]报道，MS培养基中添加0.5mg/LBA有利于SH系苹果矮化砧离体茎尖的分化，其有效分化率为50%以上，且经过20~30代的继代培养，增殖倍数仍稳定在2.9~4间。MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L培养基为苹果砧木M9、M26的最佳继代培养基，最高分化系数分别达到4.4和4.6。MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.3mg/L培养基为八棱海棠和平邑甜茶的最佳继代培养基，其分化系数较高，分别为5.1和4.6。高国训等[59]在对柱型苹果品种进行茎尖培养时发现，当培养基中BA浓度较低时，柱型苹果舞姿，短枝型金矮生和普通型苹果品种基本都可以正常增殖，当BA浓度较高时，短枝型和普通型品种生长增殖受到强烈抑制。裴东等[60]也认为，培养基中植物生长调节剂的种类、浓度和配比决定了组织、器官的发育和分化方向。王淼淼等[61]试验证明，适宜于苹果矮化砧木新品系“矮砧6号”继代繁殖的培养基为MS培养基附加1.0mg/L的6-BA和0.05~0.10mg/L的NAA，增殖系数较高，为4.53；适宜组培苗生根的培养基为1/2MS附加1.0mg/L的IAA和0.4mg/L的IBA，生根苗根系发育良好，生根率和移栽成活率均高达90%以上。吴丽君[62]发现红叶石楠组培苗继代周期、年增殖率在很大程度上受GA3含量的影响，在生根培养基中添加GA3有效地缩短了生根诱导及生根培养的时间,使红叶石楠组培快繁的效率提高。杨春梅等[63]发现在培养基中加入适量的GA3可以促进满天星组培苗生长。总之，要想使组培苗达到理想的生长分化效果，就必须合理的调节培养基的种类和激素配比。1.1.4.2组织培养存在的主要问题1.1.4.2.1褐变褐变是在植物组织培养过程中，外植体经切割、消毒处理后，切口附近细胞受伤，酚类化合物由组织内溢出，与多酚氧化酶接触被催化成褐色的醌类物质，使外植体、细胞和培养基等变褐，并且抑制其他酶系统的活性，从而造成组织代谢活动紊乱、影响了培养材料正常的生长分化，甚至导致生长停滞和死亡的现象。6 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁引起外植体材料褐变现象的原因很多，可能是多种因素同时作用的结果[64]，如取材时间[65]、消毒剂种类和消毒时间[66]以及培养基激素水平[67]等。刘杰[68]等在梨组织培养过程中发现，外植体的品种、采样时期以及外植体内酚类物质的含量等因素都对外植体材料的褐变率和褐变程度有显著影响。在培养基中添加适量聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗坏血酸（Vc）或活性炭（AC）等抗褐剂，或将外植体在抗坏血酸水溶液中浸泡30分钟后再接入培养基,均可显著减少鸭梨外植体的褐变现象。此外，鸭梨外植体经6h的低温（4℃）处理后再接种，或将外植体接入培养基后于4℃低温条件中培养12～24h,可明显减轻外植体材料的褐变程度。刘兰英[67]在薄壳香核桃的组培快繁过程中发现，细胞分裂素和无机盐浓度较高以及一定的高温等原因都会显著提高组培苗的褐变率；外植体材料采集部位不同，其木质化程度及生理代谢活动存在一定差异，外植体材料褐变程度也不同，合理应用抗氧化剂可以减轻外植体材料的褐变程度。李川[69]、陈蕾[70]等也认为通过适当时间和温度的低温预处理、调整激素水平、加入合适的抗氧化剂或吸附剂等均可减轻褐变对组织培养的危害。1.1.4.2.2玻璃化玻璃化是植物组织培养过程中易出现的特有的生理失调或生理病变现象。玻璃化现象表现为组培苗生长异常，叶片和嫩梢甚至整个组培苗呈现水晶透明或半透明水渍状，组织失绿，植株矮小肿胀，叶片纵向皱缩卷曲、脆弱易碎，器官功能不全，分化能力差，严重影响繁殖速率，阻碍组培快繁、茎尖脱毒和工厂化育苗的进程。引起植物组培苗玻璃化的原因很多，如外植体的种类、取材部位和大小、培养基中无机盐浓度以及激素配比等。秦静远等[71]试验发现，大叶相思的幼叶叶片和顶芽在组织培养过程中更容易发生玻璃化现象；取未木质化的当年生枝条进行组织培养，外植体材料几乎全部玻璃化；当外植体材料较小，长度低于0.5cm时容易发生玻璃化现象。可能是由于外植体较成熟的组织中含有某种物质可以防止玻璃化现象发生，也可能是由于外植体较大时其分生组织距离培养基表面较远，使组培材料生长环境的水分状况得到改善的原因。无机盐的浓度对组培苗玻璃化的发生有重要影响，在一定范围内减少铵态氮的比例可以有效降低玻璃化现象的发生，有利于组培苗的增殖。邹恩强等[72]在苹果砧木M9组织培养过程中发现随着培养基中铵态氮浓度的降低，组培苗玻璃化的程度也随之减小。李佳莹等发现[73]桃在2MS培养基上进行组织培养，玻璃化率高达30%以上。王爱芝等[74]在花楸的组织培养过程中发现花楸幼胚在WPM诱导培养基上玻璃化苗的发生率高达59.9%，比MS培养基上的玻璃化率高出25%。琼脂、蔗糖的浓度对组培苗玻璃化现象的发生也有一定影响。琼脂的浓度与培7 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文养基的衬质势有关，适当提高琼脂的浓度，可以降低培养基的衬质势，从而减少了组培苗玻璃化现象的发生[75]。蔗糖不仅能够作为植物组织培养中的碳源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架，而且可以使培养基维持一定的渗透压，在一定范围内玻璃苗发生率随蔗糖浓度的增高而降低[71]。何芳兰[76]等在高山杜鹃的组织培养中发现，通过提高琼脂和蔗糖的浓度，可以在不同程度上降低高山杜鹃试管苗玻璃化现象发生的概率。当琼脂浓度高达1.0%时，试管苗玻璃化率仅为7.23，琼脂浓度为0.4%时，玻璃化率高达33.32%；蔗糖浓度为2%时，玻璃化率可高达30%以上，而蔗糖浓度为3%~4%时有利于高山杜鹃茎尖增殖培养，且玻璃化率相对较低，为12~15%。培养基的激素水平影响组培苗的生长分化，所以对组培苗玻璃化现象的发生也具有重要影响，培养基中细胞分裂素的含量过高，可促使组培苗玻璃化现象的发生。师校欣等[77]在M7苹果砧木和富士苹果等材料的组织培养研究中发现，培养基中BA含量的高低，对组培苗玻璃化现象的发生有直接影响，随着BA浓度的升高，玻璃化率显著提高，当培养基中BA含量为0.5mg/L时，玻璃化率为10%，BA含量为1.5mg/L时，玻璃化率则高达50%。高遐红等[78]也认为，培养基细胞分裂素含量过高，易引起组培苗玻璃化现象的发生。Mujib等[79]认为BA是组培苗玻璃化现象发生的重要根源之一，一定浓度的BA可诱导组培苗细胞分裂活动增强，加上衬质势高，使新分裂的细胞膨胀、伸长，生长发育紊乱，从而产生玻璃化的组培苗。所以通过在适宜时期选择适宜的外植体材料、适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度、降低无机盐浓度以及控制细胞分裂素的水平等措施均可预防或减轻组培苗玻璃化现象的发生。此外，培养条件和封口材料也很重要。使用通透性较好的封口材料既能较好地防治杂菌又可以保证瓶内外空气正常交换，克服了玻璃苗的形成[80-82]。通过使用合适的封口材料，减小接种密度，降低瓶内湿度，增加培养容器的通气度等措施可以有效降低组培苗玻璃化率。师校欣[77]等发现在培养基中加入1.5-2.0g/L的PVP可显著抑制苹果组培苗玻璃化现象的发生。也可以通过增加自然光照的方法，促进玻璃苗成熟，加快木质化，使玻璃化现象消失。1.2选题依据和目的意义苹果枝干轮纹病已成为制约我国苹果产业实现优质高效生产的关键因素之一，全面了解苹果枝干轮纹病的发生状况和发生规律对有效防治苹果枝干轮纹病有重要的指导意义。目前，已有关于国内苹果枝干轮纹病发生和防治相关报道[5,83-85]，但针对河北省苹果主产区苹果枝干轮纹病的发生状况的研究尚不全面。目前生产上主要采取化学防治措施防治苹果枝干轮纹病，有些常规化学杀菌剂，如戊唑醇、甲基硫菌灵和多菌灵等具有较好的防治效果，但长期单一使用容易使病原菌产生抗药性，8 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁筛选新的防治苹果枝干轮纹病的有效药剂对指导生产意义重大。因此本研究通过对河北省7个苹果主产区12个代表县的果园枝干轮纹病发生状况的调查，并开展6种药剂对轮纹病菌菌丝生长的室内抑制效果试验和田间防效测定，以期为河北省苹果枝干轮纹病的防治提供理论依据和技术支撑。选用抗枝干轮纹病苹果砧木是预防苹果枝干轮纹病的重要途径之一。与种子繁殖、扦插和压条繁殖等传统的繁殖方式相比，利用组织培养技术繁育自根苗可以在室内进行，且环境条件可控，不受季节和土地限制，繁殖系数高、周期短，还能获得无毒苗木，是高效率繁殖优质苗木的最佳方式。本试验以两种抗轮纹病苹果砧木J35-8和1-1-10-8为试材，采用茎尖培养的方法，通过调节启动培养基、继代培养基和生根培养基的激素配比，筛选适宜于两种苹果砧木外植体诱导成活、增殖培养与组培苗生根的最佳培养基配方，建立其快速繁殖体系，以期为抗轮纹病苹果砧木在生产上的应用提供材料。9 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文2材料与方法2.1河北省苹果枝干轮纹病的发生2.1.1试验地点选取河北省承德、张家口、唐山、保定、石家庄、衡水和邢台7个苹果主产地区中12个有代表性的苹果主产县66个苹果生产园进行苹果枝干轮纹病发生和防治状况的调查，果园管理水平一般。2.1.2试验时间于2014年3~4月份和7~8月份进行苹果枝干轮纹病田间发生情况调查。两次调查均按地理位置由南至北的顺序依次进行。2.1.3试验方法采用棋盘式选树方法（隔2行选1行，隔5株选1株）选取调查用树，以调查枝干病斑为主，同时记录果园的栽培品种、树龄、地形、海拔高度、栽培管理水平和采取的防治方法等详细信息。果树发病等级参照国立耘苹果枝干轮纹病病害分级标准，分为0~4级共5个发病等级。0级：免疫，树体无轮纹病瘤分布；1级：树体分布有零星散生轮纹病瘤；2级：主干、骨干枝轮纹病瘤较为密集或有少量连片的轮纹病斑；3级：主干、骨干枝上有较多连片的轮纹病斑，主干病斑面积范围为主干面积20%以上；4级：主干、骨干枝上有大量连片的轮纹病斑，主干病斑面积范围为主干面积的60%以上。2.1.4数据处理与分析根据发病等级计算出各地区各调查样点苹果枝干轮纹病的发病率和病情指数，分析不同品种、树龄和不同地区苹果枝干轮纹病发生状况的差异。发病率(%)=发病植株数/调查植株总数×100%病情指数=∑(调查级数×该级调查株数)/(调查总株数×最高级数)10 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁2.2苹果枝干轮纹病的防治2.2.1不同杀菌剂对轮纹病菌室内抑菌力的测定2.2.1.1供试材料供试病原菌：苹果轮纹病菌由河北农业大学植物保护学院提供。该菌最适生长条件为：温度28℃，pH7.2，在偏酸或偏碱条件下菌丝生长状态较差，该菌对葡萄糖和蔗糖这两种碳源的利用最好。轮纹病菌于4℃冰箱密封保存，试验前对其进行连续2~4代（每代培养4天）的复壮培养，直至轮纹病菌菌丝生长迅速、菌落生长状态一致时备用。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），培养基用于苹果轮纹病菌的复壮培养、增殖培养以及选定农药室内抑菌力的测定。培养基采用常规制备方法，121℃高温高压灭菌20分钟，趁热分装至直径90mm的玻璃皿中，制成PDA培养基平板。供试药剂：本试验选用的药剂为：戊唑醇（12.5%水乳剂，河北冠龙农化有限公司生产）、甲基硫菌灵（70%可湿性粉剂，山东青岛海利尔药业集团股份有限公司生产）、波尔多液（浆）、树安康、菌清和腐愈灵，其中树安康、菌清和腐愈灵为国家苹果产业技术体系病虫害防控研究室提供的防治苹果枝干轮纹病的新型药剂，树安康为粉剂，用于喷施，由杀菌剂和植物所需营养成分制成；其余两种药剂为糊剂，用于涂抹，二者均由杀菌剂和植物所需的天然提取物等多种营养成分精制而成，直接涂抹，可抑制病原菌、封闭伤口、补充有机营养，其中腐愈灵有效成分为甲基硫菌灵并特别导入无公害愈合剂FDS，可迅速促进伤口愈合。2.2.1.2不同药剂抑菌力测定试验方法带药PDA培养基平板的制备：将喷施的药剂戊唑醇、甲基硫菌灵、波尔多液和树安康用无菌水制成需要浓度的母液，待灭菌后的PDA培养基温度降至60℃以下时在超净工作台上分别加入药剂母液制成带药培养基平板，培养基中药剂浓度与田间防治试验浓度保持一致（表5）。涂抹型药剂腐愈灵、菌清采用“纸片法”测定各药剂对轮纹病菌菌丝生长的抑制率：用直径8mm的打孔器打取足够数量的小圆滤纸片置于培养皿中高温高压灭菌后备用，待PDA培养基平板降温凝固后在超净工作台上用滤纸片蘸取药剂，将带药滤纸片置于PDA培养基中间位置，每皿放三个滤纸片，隔开15mm左右，呈“品”字形排列，封口备用。11 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文抑菌力的测定：采用菌丝生长速率法测定各药剂对轮纹病菌菌丝生长的抑制率。在超净工作台上制备带药培养基平板，每处理4皿，同时设加等量无菌水的培养基平板为空白对照。选取预先培养好的生长状态良好且一致的病原菌用8mm打孔器由培养皿边缘打取菌丝长势最好的菌饼，以保证菌饼活力旺盛且生长一致，将菌饼接种在不同带药PDA培养基平板的中间位置，每皿接种三个菌饼，呈“品”字形排列，涂抹型药剂培养基平板要将菌饼接种于带药滤纸片上，使菌饼的菌丝面接触带药培养基或滤纸片。在25℃的恒温培养箱中黑暗倒置培养，当空白对照的菌丝长满培养皿时（5d左右），用十字交叉法测量各处理菌落的纵横径，计算出各处理对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制率。抑制率(%)=［1-(处理菌落直径－菌盘直径)/(对照菌落直径－菌盘直径)］×1002.2.2几种药剂对苹果枝干轮纹病田间防治效果2.2.2.1试验地点田间试验地点为河北省保定市满城县顺民村苹果园，灌溉便利，栽培管理水平一般，主栽品种为红星，树龄12年，苹果枝干轮纹病历年发生严重。2.2.2.2不同药剂田间防效试验方法防治试验于2014年4月至10月进行，每隔20d左右施药一次，7~8月份降雨量多时可适当缩短施药周期。各药剂使用浓度均参考药剂生产厂家在病害防治使用说明上所推荐的用药浓度。其中12.5%戊唑醇水乳剂1150倍液，70%甲基硫菌灵可湿性粉剂800倍液，树安康200倍液。波尔多液设置两个处理方式，一是只喷施波尔多液（硫酸铜:生石灰:水=1:2:200），二是在喷施波尔多液的基础上，于3月中旬和7月上旬各涂抹一次波尔多浆（硫酸铜:生石灰:水=1:3:25）。菌清和腐愈灵为糊剂，不需要稀释可直接涂抹施用。本试验采取刮除病斑后施药和不刮病斑直接施药两种施药方式。以戊唑醇、甲基硫菌灵为常规防治对照，清水处理做空白对照，测试不同药剂对苹果枝干轮纹病的防治效果。共16个处理，单株小区，5次重复。11月下旬从发病部位表面形态上比较各处理的防治效果。未刮除病斑直接施药的处理观察病瘤脱落和翘皮发生的数量和面积比例，已刮除病斑的树木观察其施药部位的复发病瘤数，计算防治效果。防治效果(%)=(对照区病斑数-处理区病斑数)/对照区病斑数×10012 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁2.32种抗轮纹病苹果砧木的组培快繁2.3.1试验材料选取由河北农业大学园艺学院苹果课题组研究选育，并经过田间自然发病调查和1~2年接菌试验验证的轮纹病抗性砧木J35-8和1-1-10-8，作为试验材料，进行砧木茎尖培养快速繁殖技术的研究。2014年3月下旬，自河北省保定顺平县河北农业大学园艺学院苹果砧木试验园取抗轮纹病砧木上具饱满芽的未萌芽枝条，清洗后于光照培养箱内进行水培，光暗周期12h/12h，光照条件下温度为24±2℃，黑暗条件下温度为15±2℃，培养箱湿度保持70%以上，每天喷雾保湿并更换清水一次。待芽萌发并长到1.5cm以上时，切取嫩梢放到三角瓶中，经流水冲洗35次后备用。2.3.2试验方法2.3.2.1外植体的消毒和接种将用流水冲洗干净的外植体材料置于无菌的100ml三角瓶中，在超净工作台上用0.1%HgCl2溶液进行消毒处理，外植体消毒时间设置8、9、10和11min四个处理，浸泡时轻轻摇晃三角瓶将外植体材料上的气泡赶出，使消毒处理充分，HgCl2溶液浸泡后，用无菌水冲洗4~5次，然后用枪状镊取出置于无菌的玻璃皿中，最后切除外植体伤口部位褐变的部分，接种于启动培养基（MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L）上。两周后调查外植体成活、褐变以及污染情况。2.3.2.2外源激素对抗轮纹病苹果砧木外植体启动培养的影响启动培养基以MS为基本培养基，其中蔗糖35g/L，琼脂6.2g/L，pH为6.0-6.5，NAA浓度为0.05mg/L保持不变，将6-BA设为0.5、0.75、1.0和1.5mg/L4个浓度梯度（表7、8），共4个处理，每个处理接30个茎尖，重复3次。接种后置于光照培养室内培养，培养温度为25±2℃，光照强度2000-3000Lx，光/暗周期12h/12h。接种25d后，统计外植体诱导成活率。诱导成活率（%）=诱导成活外植体数/接种外植体数×100%。2.3.2.3外源激素对抗轮纹病苹果砧木组培苗继代增殖的影响继代培养基以MS培养基为基本培养基，其中蔗糖35g/L、琼脂6.2g/L，6-BA设为0.5、1.0和1.5mg/L三个浓度梯度，NAA设为0.05、0.075和0.1mg/L三个浓13 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文度梯度，两两组合，共9个处理（表9、10）。选取启动培养基中生长健壮一致的芽苗，分别接种至上述9个不同继代培养基中，每个处理20株，各重复3次，培养条件与启动培养保持一致。接种后30d左右统计接芽的增殖系数和分枝高度。增殖系数=增殖茎尖数/接种茎尖数×100%。2.3.2.4外源激素对抗轮纹病苹果砧木组培苗生根的影响选择生长健壮、长势一致、高2.0cm以上的继代苗，分别接种于不同浓度配比的生根培养基中（表11、12）。生根培养基以1/2MS为基本培养基，其中蔗糖15g/L，琼脂6g/L，IAA浓度为1.0mg/L保持不变，IBA设置为0.3、0.4、0.5、0.6mg/L四个浓度梯度，每个处理20株，重复3次，培养条件同启动培养。接种20d后统计生根率、各生根苗的生根数和生根长度。生根率（%）=诱导生根茎段数/接种茎段数×100%。2.3.2.5炼苗与移栽生根培养20d左右，统计生根率、根数和根长后将生根苗移至温室中炼苗，经7d左右将三角瓶的封口膜解下，再经2-3d炼苗后移栽至营养钵。移栽前要先配制培养机质，用0.1%多菌灵溶液将体积比为1:1的蛭石和草炭混合均匀，湿度以“手握成团不滴水，落地即散”为宜。将混合好的培养基质装入事先准备好的营养钵中，栽入小苗，轻轻压实基质。移栽后立即用0.1%多菌灵溶液浇透，最后覆盖棚膜，以保温保湿。移栽后每3d喷施1次多菌灵溶液，一周左右开始放风锻炼，经过2周左右揭开棚膜，20d左右幼苗长出新叶，统计成活率。移栽成活率（%）=移栽成活株数/总移栽株数×100%。14 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁3结果与分析3.1河北省苹果枝干轮纹病的发生状况3.1.1不同地区苹果枝干轮纹病病情差异从表1可以看出，河北省苹果枝干轮纹病发生普遍且病情严重。春季河北省苹果枝干轮纹病的发生状况调查结果显示：该病害在河北省的总体发病率为63.54%，病情指数47.25。各地区苹果枝干轮纹病的发生状况存在一定差异。河北省受苹果枝干轮纹病危害最轻的是承德地区，发病率为24.38%，病情指数13.70，其次为张家口地区，发病率48.00%，病情指数36.28，第三为保定地区，发病率为63.24%，病情指数33.98。其他四个地区苹果枝干轮纹病的危害严重，发病率均达到70%以上，病情指数均高达55以上。夏季的调查结果显示（下文各结论均由夏季的调查结果来说明）该病害在河北省的总体发病率为76.26%，病情指数63.70。各地区苹果枝干轮纹病的发生规律与春季一致。承德地区受苹果枝干轮纹病危害最轻，发病率为43.15%，病情指数27.73，其次为张家口地区，发病率56.64%，病情指数41.50，第三为保定地区，发病率为82.66%，病情指数65.89。其他四个地区苹果枝干轮纹病的危害严重，发病率均达到80%以上，病情指数均高达70以上，其中唐山地区的发病率最高，为92.63%，邢台地区的病情指数最高，高达84.38。夏季各地区苹果枝干轮纹病的危害程度明显高于春季，各地区夏季苹果枝干轮纹病的发病率比春季高出2.99%~25.19%不等，病情指数增长了5.22~41.14，其中石家庄地区发病率和病情指数的增幅最大。表1河北省不同地区苹果枝干轮纹病病情比较Table1TheoccurrenceofBotryosphaeriacankerofappleinsevenareasinHebeiprovince春季夏季SpringSummer调查地点平均树龄/年海拔高度/mLocationsAgeAltitude发病率/%病情指数发病率/%病情指数IncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexa承德6.6449024.3813.7043.1527.73张家口7.6666448.0036.2856.6441.50唐山7.38474.8855.8792.6372.09保定6.4113779.6753.9882.6665.89石家庄12.142663.2433.9888.4378.12衡水9.882476.1964.6483.1376.21邢台9.1419178.4172.0587.1784.38总体8.46--63.5447.2576.2663.7015 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文3.1.2不同树龄苹果树枝干轮纹病病情差异从表2可以看出，河北省苹果枝干轮纹病的危害随着树龄的增加而显著加重，0~5年生幼树的枝干轮纹病发病率为44.71%，6~10年生果树发病率为80.6%，11~15年生的果树发病率达94.47%，树龄16年以上的果树全部发病，发病率100%；从病情指数来看，树龄为0~5年、6~10年、11~15年和16年以上苹果树的病情指数依次为：33.55、65.2、87.37和98.53。从各地区不同树龄苹果枝干轮纹病的发病情况来看，唐山地区0~5年的幼树枝干轮纹病病害危害严重，发病率高达90.00%，病情指数76.42；而承德和邢台0~5年的幼树的病情相对较轻，发病率分别为26.97%和23.00%，病情指数分别为15.72和10.23。6~10年生的果树受苹果枝干轮纹病危害的程度明显高于0~5年生的小树，其中承德地区的危害最轻，发病率和病情指数分别为42.88%和18.80，其次为张家口地区，病情指数和发病率分别为52.00%和33.33%，再次为石家庄地区，枝干轮纹病发病率为78.99%，病情指数48.10，其他地区发病严重，发病率均高达90.00%以上，病情指数高达80以上，其中保定和邢台地区苹果枝干轮纹病发病率均为100%。11~15年生苹果树，除张家口地区的发病率较低为61.28%外，其他各地区均为100%，病情指数最低的是张家口地区，其次为承德和石家庄地区，三者的病情指数依次为49.67、72.22和89.73，其他地区枝干轮纹病病情指数均为100。河北省各地区16年及以上树龄的苹果树全部发生枝干轮纹病，发病率100%，除承德地区外所调查的果树全部为4级发病，病情指数为100。表2不同树龄苹果树枝干轮纹病病情比较Table2TheeffectofdifferentagesontheoccurrenceofBotryosphaeriacankerofapple0-5a6-10a11-15a≥16a调查地点发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数LocationsIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexa承德26.9715.7242.8818.8010072.2210091.18张家口----52.0033.3361.2849.67----唐山90.0076.4296.4480.25100100100100保定51.8430.5210089.98100100100100石家庄24.1335.3478.9948.1010089.73100100衡水52.3333.0493.9088.33100100100100邢台23.0010.2310098.02100100100100平均44.7133.5580.6065.2694.4787.3710098.5316 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁3.1.3不同品种苹果枝干轮纹病病情差异由表3可以看出，河北省各地区不同品种间苹果枝干轮纹病发病程度不同，在全省范围内枝干轮纹病发病最轻的品种是国光，发病率为25.80%，病情指数为11.28；其次为斗南，发病率为49.82%，病情指数为19.35；其他品种苹果枝干轮纹病发病率由低至高依次为富士、嘎啦、王林和红星，发病率分别为76.25%、82.91%、89.06%和91.09%，但富士的病情指数高于嘎啦，二者的病情指数分别为66.18和62.87，红星的病情指数最高，为82.93。河北省各调查地区中衡水地区的调查品种共有4个，且各品种的树龄相近，具有一定的代表性，结果表明发病最严重的品种是红星，其次为富士，二者没有明显的差异，发病率分别为84.03%和83.83%，病情指数分别为76.97和75；其次为嘎啦，发病率为67.55%，病情指数为54.11；发病最轻的品种是斗南，发病率为47.00%，病情指数为17.65。富士苹果在河北省各地区均有栽培，且普遍受枝干轮纹病的严重危害，其中，枝干轮纹病发生较轻的是张家口和承德地区，发病率分别为56.64%和67.46%，病情指数分别为41.50和49.48，唐山地区富士苹果的发病情况最严重，发病率为100%，病情指数为99.06。17 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文表3不同品种苹果枝干轮纹病病情比较Table3TheeffectontheoccurrenceofBotryosphaeriacankerofapple富士红星王林嘎啦斗南国光地区FujiHongxingWanglinGalaDounanGuoguangLocations发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数发病率/%病情指数IncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexaIncidencesDiseaseindexa承德67.4649.48----------------25.8011.28张家口56.6441.50--------------------唐山10099.06----10090.4886.4462.35--------保定78.5164.2398.1588.8978.1258.49------------石家庄73.0064.57--------94.7472.1652.6321.05----衡水83.8375.0084.0376.97----67.5554.1147.0017.65----邢台74.3369.42--------------------合计76.2566.1891.0982.9389.0674.4982.9162.8749.8219.3525.8011.2818 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁3.1.4防治苹果枝干轮纹病的常规药剂及方法。在河北省各果园的调查过程中，同时记录了部分果园防治苹果枝干轮纹病所用的药剂。调查中发现，果农主要通过刮除病斑结合喷施化学杀菌剂的方式防治苹果枝干轮纹病。大部分果农选用多菌灵、甲基硫菌灵、戊唑醇和石硫合剂等化学杀菌剂进行苹果枝干轮纹病的防治，通常能达到较好的防治效果，也可同时防治果树其他病害，另外禁止使用的高毒农药福美胂仍然有少部分果园还在违规使用。调查发现有个别栽培管理水平较高的苹果园枝干轮纹病的发生状况明显较同地区果园轻。保定市曲阳县寺南庄村苹果枝干轮纹病总体发病率高达84.56%，病情指数41.79，该村村民李增勋家4年生富士果园管理精细，发病程度较轻，发病率40%，病情指数为20.00，低于该村整体发病情况的1/2。李增勋防治苹果枝干轮纹病采用的杀菌剂为多菌灵、波尔多液和烯唑醇等，各种杀菌剂交替轮换施用，于春季开花前后进行第一次喷药防治，以后每隔半个月左右喷施一次杀菌剂，直至苹果采收前后进行最后一次施药，取得了较好的防治效果。保定市满城县顺民村张金霞家12年生红星果园苹果枝干轮纹病的防治效果也较理想，在生长季节刮除病斑后涂抹波尔多浆（硫酸铜:生石灰:水=1:3:25）或喷施波尔多液（硫酸铜:生石灰:水=1:2:200），对枝干轮纹病的防治效果可达到90.00%以上。保定市顺平县何家营村河北农业大学园艺学院试验园中3年生富士苹果树通过在树干病斑上涂抹愈合剂也达到了较好的防治效果，病斑翘皮、脱落现象明显。3.2苹果枝干轮纹病的防治3.2.1不同药剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制效果结果表明，各药剂对轮纹病菌菌丝生长均有较高的抑制效果，轮纹病菌菌饼在戊唑醇和波尔多液的带药培养基平板上的生长量为零，抑菌效果达到100%，其次为腐愈灵，抑菌效果为99.71%，3种处理差异不显著，再次为菌清，抑菌效果为95.53%，最后为树安康和甲基硫菌灵，树安康培养基平板上的菌饼菌丝生长直径为6.99mm，抑菌效果为90.60%，甲基硫菌灵培养基平板上的菌饼菌丝生长直径最大，为7.79mm，其对菌丝生长的抑制效果最低，为91.47%，见表4、图版1。19 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文表46种药剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制率Table4Theinhibitioneffectofsixfungicidesonmyceliumgrowth处理编号药剂菌丝生长直径/mm抑菌效果/%ThenumberoftreatmentFungicideMyceliumdiameteInhibitioneffectonmyceliumgrowth戊唑醇10.00±0.00d100.00±0.00aTebuconazole波尔多液20.00±0.00d100.00±0.00aBordeauxpaste腐愈灵30.24±0.49d99.71±0.38aHealingagent菌清44.10±0.91c95.53±0.81bJunqing树安康56.99±0.61b91.47±0.10cShuankang甲基硫菌灵67.79±0.60a90.60±0.97dThiophanatemethyl20 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁ABCDEFG图版1各药剂对轮纹病菌菌丝生长的抑制力Plate1TheinhibitioneffectofseveralfungicidesonmyceliumgrowthA戊唑醇E菌清B波尔多液F甲基硫菌灵C腐愈灵G对照D树安康21 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文3.2.27种药剂处理对苹果枝干轮纹病的田间防治效果从表5中可以看出，7种药剂处理均对苹果枝干轮纹病具有较显著的防治效果。未刮除病斑的处理，枝干发生明显的翘皮和病斑脱落现象，刮除病斑的处理，枝干光滑、复发病瘤数量少，如图版2。未刮除病斑的处理中，防治效果最好的药剂是戊唑醇，防治效果为90.90%，显著高于其他处理；其次为波尔多浆和腐愈灵，防治效果分别为81.93%和81.40%；其余四种药剂处理，除甲基硫菌灵的防治效果较低为66.83%外，其余处理的防治效果均在75.00%以上。刮除病斑后施药处理的防治效果明显高于不刮病斑直接施药的处理，刮除病斑施药处理防治效果最好的是波尔多浆，防治效果为98.64%，其次为戊唑醇和腐愈灵，防治效果分别为98.37%和97.55%，三者在5%显著水平上差异不显著；除甲基硫菌灵的防治效果最低，为89.40%外，其他药剂的防治效果均在90%以上。表5不同药剂处理对苹果枝干轮纹病田间防治效果Table5CurativeeffectsofSeveralfungicidesontumordevelopmentonapplebranchescausedbyBotryosphaeriadothidea防治效果/%处理编号药剂CurativeeffectsThenumberoftreatmentFungicides不刮除病斑刮除病斑WithoutscrapethelesionScrapethelesion波尔多浆181.93±0.81b98.64±1.62aBordeauxpaste戊唑醇290.90±0.46a98.37±1.54aTebuconazole腐愈灵381.40±1.14bc97.55±1.82aHealingagent菌清479.10±1.40cd95.65±0.00bJunqing波尔多液576.90±0.82de92.66±1.99cBordeauxmixture树安康676.23±2.51e90.22±1.16dShuankang甲基硫菌灵766.83±1.93f89.40±1.39dThiophanatemethyl22 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁ABCDEFGHIJ图版2各药剂对苹果枝干轮纹病的田间防治效果Plate2CurativeeffectsofseveralfungicidesontumordevelopmentonapplebranchescausedbyBotryosphaeriadothideaA戊唑醇（刮）B戊唑醇（未刮）C波尔多浆（刮）D波尔多浆（未刮）E甲基硫菌灵（刮）F甲基硫菌灵（未刮）G菌清（刮）H腐愈灵（刮）I树安康（刮）J对照（刮）23 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文3.3抗轮纹病苹果砧木的组培快繁3.3.1HgCl2消毒时间对外植体消毒效果的影响砧木外植体用0.1%HgCl2消毒的最适时间为10min。从表6可以看出0.1%HgCl2消毒时间对外植体成活具有较大影响，在8~11min之间，随消毒时间增长，外植体真菌污染率呈降低趋势，消毒处理11min时外植体的污染率为0；但消毒时间越长外植体褐变率也越高，消毒处理11min的褐变率高达82.5%。消毒处理10min时，外植体污染率和褐变率可控制在较低水平，分别为10.0%和25.0%，外植体接种成活率最高，为65.0%，所以外植体消毒的最适时间为10min。表6HgCl2消毒时间对外植体灭菌效果的影响Table6EffectofdifferentdisinfectiontimeofHgCl2ontheexplantssteriliizingeffect消毒时间/min接种芽数/个污染率/%褐变率/%成活率/%DisinffectiontimeNumberofvaccinationsPollutionrateTherateofbrowningSurvivalrate84067.510.022.594035.022.542.5104010.025.065.01140082.517.53.3.2不同浓度6-BA处理对芽诱导成活的影响由表7和表8可以看出，培养基中NAA浓度为0.05mg/L不变，6-BA的浓度对两种砧木外植体诱导成活和褐变现象的发生有较大影响。6-BA浓度在0.5~1.0mg/L时，外植体的褐变率随6-BA浓度的增高而降低。当6-BA浓度为1.0mg/L时1-1-10-8和J35-8砧木外植体褐变率最低，分别为18.55%和10.00%。褐变率越低，诱导成活率越高，当6-BA浓度为1.0mg/L时，两个砧木的诱导成活率分别为77.14%和88.75%，显著高于其他三个浓度。其中6-BA浓度为0.5mg/L时，砧木外植体的褐变率最高，分别达到33.17%和46.67%，诱导成活率最低，分别为39.78%和44.25%。综合以上试验结果，本试验中最适宜于抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8和J35-8启动培养的植物生长调节剂配比为NAA0.05mg/L+6-BA1.0mg/L。24 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁表76-BA浓度对1-1-10-8外植体诱导培养的影响Table8Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAontheinductioncultureoftheapplerootstock1-1-10-8处理编号NAA浓度/mg·L-16-BA浓度/mg·L-1诱导成活率/%褐变率/%ThenumberTheconcentrationTheconcentrationSurvivalrateTherateofbrowningoftreatmentofNAAof6-BA10.050.5039.78±1.38d33.17±0.78a20.050.7561.72±1.94b26.49±0.60b30.051.0077.14±5.54a18.55±0.34b40.051.5047.20±1.62c25.01±0.34c表86-BA浓度对J35-8外植体诱导培养的影响Table7Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAontheinductioncultureoftheapplerootstockJ35-8处理编号NAA浓/mg·L-16-BA浓/mg·L-1诱导成活率/%褐变率/%ThenumberTheconcentrationofTheconcentrationofSurvivalrateTherateofbrowningoftreatmentNAA6-BA10.050.5044.25±3.40d46.67±3.51a20.050.7572.50±3.32b23.33±3.51c30.051.0088.75±3.40a10.00±3.00d40.051.5058.75±3.40c31.33±5.13b3.3.3不同6-BA与NAA配比对组培苗继代增殖的影响从表9和表10中可以看出，苹果砧木J35-8在继代增殖过程中容易发生玻璃化现象，玻璃化率高于10.00%，处理9中的继代苗玻璃化率高达32.36%，但砧木1-1-10-8在继代培养基筛选试验中未发现玻璃化苗，组培苗生长状态良好（图版3-B、图版4-C）。从表9中可以看出，6-BA浓度一定，NAA浓度在0.05~0.1mg/L范围内，1-1-10-8砧木继代苗的增殖系数和分枝高度均呈现先上升后下降的趋势，NAA浓度在0.075mg/L时增殖系数和分枝高度最大。6-BA浓度为1.0mg/L时继代苗的增殖系数总体上高于其他浓度。增殖系数最高的是处理5，为12.71，显著高于其他处理，其次为处理4，增殖系数为10.27，处理1的增殖系数最低，仅5.13，不足处理5和处理4增殖系数的1/2。分枝高度最高的也是处理5，为5.13cm，其次为处理9和处理8，分枝高度分别为4.66和4.61cm，再次为处理4，分枝高度为3.99cm，处理1的分枝高度最低，分枝高度小于2.00cm。所以，处理5适宜应用于抗轮纹病苹果砧25 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文木1-1-10-8的增殖培养，其植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.075mg/L。表96-BA和NAA浓度对苹果砧木1-1-10-8组培苗增殖的影响Table9Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAandNAAonthemultiplicationoftheapplerootstock1-1-10-8处理编号6-BA浓度/mg·L-1NAA浓度/mg·L-1增殖系数玻璃化率/%分枝高度/cmThenumberTheconcentrationTheconcentrationCoefficientTherateHeightoftreatmentof6-BAofNAAofmultiplicationofvitrification10.50.051.91±0.46e5.13±1.30e0.0020.50.0752.47±0.49d6.27±1.75de0.0030.50.12.0±0.30de5.33±1.68e0.0041.00.053.99±0.72c10.27±2.93b0.0051.00.0755.13±0.71a12.71±4.53a0.0061.00.14.18±0.64c7.71±3.60cd0.0071.50.054.05±0.64c7.00±2.00de0.0081.50.0754.61±0.53b9.54±2.15bc0.0091.50.14.66±0.71b8.29±2.16bcd0.00从表10中可以看出，6-BA浓度在0.5~1.5mg/L范围内，J35-8砧木组培继代苗的增殖系数呈现先上升后下降的趋势，6-BA浓度为1.0mg/L处理下增殖系数显著高于其它浓度处理，高达7.80~8.50，6-BA浓度为1.0mg/L时，分枝高度大于4.00cm，显著高于6-BA浓度为0.5mg/L与1.5mg/L的分枝高度。6-BA浓度在0.5~1.5mg/L范围内，继代苗的分枝高度均在NAA浓度为0.075mg/L时达到最高。继代培养基筛选的9个处理中处理5的组培苗分枝高度最高，为4.63，显著高于其它处理，但处理4的增殖系数显著高于处理5，高达8.50，且组培苗分枝高度较高，为4.22cm，与处理5相差不足0.40cm，组培苗生长健壮，顶端生长旺盛，叶片深绿，玻璃化率较低（如图版4）。综合考虑增殖系数、分枝高度和组培苗生长状态等条件认为，适宜于抗轮纹病苹果砧木J35-8增殖培养的植物生长调节剂配比为6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L。26 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁表106-BA和NAA浓度对苹果砧木J35-8组培苗增殖的影响Table10Effectsofdifferentconcentrationsof6-BAandNAAonthemultiplicationoftheapplerootstockJ35-86-BA浓度/mg·处理编号NAA浓度/mg·L-1增殖系数玻璃化率/%L-1分枝高度/cmThenumberTheconcentrationCoefficientofTherateofTheconcentrationHeightoftreatmentofNAAmultiplicationvitrificationof6-BA10.50.054.24±0.10h3.26±0.06f11.14±0.73d20.50.0755.43±0.11f3.67±0.12e11.02±1.09d30.50.14.74±0.10g3.66±0.09e11.2±0.58d41.00.058.50±0.11a4.22±0.08b11.24±0.56d51.00.0757.84±0.11b4.63±0.07a11.98±0.81d61.00.17.81±0.09b4.05±0.09c12.1±0.62d71.50.056.42±0.12c3.71±0.12e28.64±0.85c81.50.0755.77±0.12d3.86±0.13d29.76±1.00b91.50.15.59±0.10e3.85±0.12d32.36±0.85a3.3.4不同IAA与IBA配比对组培苗生根及移栽成活率的影响由表11可以看出，1-1-10-8砧木各处理的外植体材料均容易生根，生根率均达90%以上，平均生根5条以上，根长为1.36cm以上，且较易移栽成活。当IAA浓度为1.0mg/L，IBA浓度为0.6mg/L时，不论生根率、生根数目和成活率都显著高于其它处理，生根率为98.06%，每株生根苗平均生根7.89条，移栽成活率达92.38%。因此，较适宜于抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8组培苗生根的培养基为：1/2MS+IAA1.0mg/L+IBA0.6mg/L。表11IAA与IBA浓度对苹果砧木1-1-10-8组培苗生根的影响Table11EffectsofdifferentconcentrationsofIAAandIBAontherootingoftheapplerootstock1-1-10-8处理编号IAA浓度/mg.L-1IBA浓度/mg·L-1生根数目/条0根长/cm生根率/%移栽成活率/%ThenumberTheconcentrationTheconcentrationThenumberThelengthRootingrateSurvivalrateoftreatmentofIAAofIBAofrootingofrooting11.00.392.66±0.64bc5.59±0.58c1.52±0.08b88.75±0.94b21.00.495.05±1.25b6.30±0.38b1.80±0.03a88.49±1.25b31.00.590.96±2.35c6.49±0.27b1.36±0.04c84.82±2.40c27 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文41.00.698.06±0.10a7.89±0.32a1.40±0.04c92.38±1.81a由表12可以看出，当IAA浓度为1.0mg/L，IBA浓度为0.3mg/L时，抗轮纹病苹果砧木J35-8组培苗不论生根率、根系长度、生根数目和成活率都显著高于其它IBA+IAA浓度处理，生根率达92.68%，每株生根苗平均生根9.35条，根长达1.36cm，移栽成活率高达100%。移栽成活后，顶端分生组织停长晚，易长出新叶（如图版3-D）。其他处理的生根率仅为60~65%，每株生根7~8条，根长小于1cm，处理3的移栽成活率为92.59%，处理2和处理4的成活率仅88.24%。因此，适宜抗轮纹病苹果砧木J35-8组培苗生根的培养基为1/2MS+IAA1.0mg/L+IBA0.3mg/L。表12IAA与IBA浓度对苹果砧木J35-8组培苗生根的影响Table12EffectsofdifferentconcentrationsofIAAandIBAontheRootingoftheapplerootstockJ35-8处理编号IAA浓度/mg.L-1IBA浓度/mg.L-1生根数目/条根长/cm生根率/%移栽成活率/%ThenumberTheconcentrationTheconcentrationThenumberThelengthRootingrateSurvivalrateoftreatmentofIAAofIBAofrootingofrooting11.00.392.68±1.53a9.35±0.08a1.36±0.04a100±0.00a21.00.464.02±1.39c7.06±0.14d0.66±0.03c88.24±6.65c31.00.565.12±1.24b7.39±0.09c0.60±0.03d92.59±7.72b41.00.662.22±6.38d8.43±0.07b0.91±0.06b88.24±8.05c28 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁ABCD图版3苹果砧木1-1-10-8的组织培养与快速繁殖Fig3Tissuecultureandrapidpropagationofapplerootstock1-1-10-8A外植体B继代培养C生根苗D生根根系29 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文ABCDEF图版4苹果砧木J35-8的组织培养与快速繁殖Fig4TissuecultureandrapidpropagationofApplerootstockJ35-8A芽苗增殖B褐变现象C继代苗玻璃化现象D生根苗叶片黄化现象E生根根系F移栽成活根系30 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁4讨论4.1河北省苹果枝干轮纹病发生状况国立耘2009年对全国苹果枝干轮纹病发生情况的调查结果显示：河北省苹果树平均树龄15.7年，枝干轮纹病发病率为78.00%，病情指数51.90。本次调查得出河北省各地区苹果树平均树龄为8.46年，发病率为76.26%，病情指数63.70。随着老龄果园的更新换代[86-87]，河北省大部分病害严重、树体郁闭的老龄果树已被最新栽培模式的幼树替代，而使树龄普遍变小。本次调查发现河北省苹果枝干轮纹病普遍发生且病情严重，枝干轮纹病的总体发病率与国立耘的调查结果相差不多，且病情指数高于国立耘的调查结果，这说明河北省苹果枝干轮纹病的危害日趋严重，树龄较小的果树受害已很严重。不同地区间苹果枝干轮纹病发生状况存在一定差异。承德地区的总体发病情况较其他地区轻，发病率43.15%，病情指数27.73，因为承德地区的海拔较高，平均海拔为490米，气温较低，且大部分果园分布于山地，果园通风透光条件好，空气湿度小，不利于枝干轮纹病的发生和发展；而唐山、衡水、邢台地区海拔较低，气温较高，地势平坦，平原果园比例较高，降水多、易积水，通透性较山地果园差，有利于病菌的繁殖以及孢子的传播和侵入，而使枝干轮纹病发生严重，其中唐山地区的发病率最高，为92.63%，邢台地区的病情指数最高，高达84.38。调查结果证明不同苹果品种枝干轮纹病发生状况不同。国光较抗病，发病率为25.80%，病情指数为11.28；斗南次之，发病率为49.82%，病情指数为19.35；富士和红星高感枝干轮纹病，发病率分别为为76.25%和91.09%，病情指数分别为66.18和82.93。不同品种的遗传特性不同，其枝条皮孔大小、密度和结构、NO含量以及抗性相关酶的活性都有很大差异，对轮纹病菌的抗性和枝干轮纹病的敏感程度就明显不同[24,88-89]。苹果枝干轮纹病的危害程度随树龄的增高而加重，0-5年生幼树枝干轮纹病发病率为44.71%，病情指数33.55，而树龄16年以上的果树枝干轮纹病发病率100%，病情指数高达98.53。树龄较高的果树苹果枝干轮纹病发生严重，可能是因为：1）树体和果园的郁闭度随着树龄的增高而增加，树体通透性降低，有利于病害发生；2）成龄果树大量结果消耗树体养分，加之栽培管理水平不高造成果树树势衰弱，抗病能力降低；3）病害治疗不彻底，树体病害逐年积累。所以苹果树栽培管理过程中应注意：1）合理整形修剪，去除过密枝条，保证树体良好的通风透光；2）合理疏花31 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文疏果，控制树体的负载量，加强栽培管理，增强树势，提高树体本身的抗病能力；3）选用有效药剂防治枝干轮纹病，并注意果园卫生，彻底清除病残体。调查中发现新建果园苗木本身带病严重，这也是造成枝干轮纹病受害严重的重要原因之一。所以加强苗期病害防治，提高苗木质量，控制带病苗木的流通很重要。4.2苹果枝干轮纹病的防治河北省以富士为主栽品种[5]，其次为元帅和红星，均为易感轮纹病品种，且苗木带病严重，一旦发生枝干轮纹病就很难根除。本调查显示只要加强预防并采取合适的防治方法，苹果枝干轮纹病是能够做到可防可控的。但适用于防治苹果枝干轮纹病的药剂种类较少，且长期单一使用同一种药剂容易使病原菌产生抗药性，所以研制和筛选新的防治枝干轮纹病的有效药剂很重要。目前已被禁用于无公害果园生产中的福美胂仍然在不少果园中使用[21]。这样不仅严重污染生态环境，而且会增加农产品中有毒化学物质的残留量，对人类健康带来潜在危害，同时也易诱致病原菌抗药性的产生[22]。所以新药剂的研制和开发不仅要重视防治效果，而且必需同时充分考虑食品安全和环境保护问题，保证新药剂安全高效。本试验中选取的防治苹果枝干轮纹病的新药菌清、树安康、腐愈灵以及常规杀菌剂波尔多液、戊唑醇和甲基硫菌灵6种药剂对苹果轮纹病病原菌菌丝生长的抑制效果均达到90.00%以上。田间防治试验中刮除病斑进行施药处理的防治效果优于直接施药处理，除甲基硫菌灵的防治效果为89.40%外，各药剂在刮除病斑后的防治效果均达到90.00%以上。在田间防治试验中，这些药剂在试验浓度条件下对植物安全，无药害情况发生，结合合理修剪，合理施肥灌水等增强树势的栽培管理措施，将来有望成为生产上防控苹果枝干轮纹病的主要药剂。试验证明刮除病斑后施药处理对苹果枝干轮纹病的防治效果更好，但发病严重时，全树大面积大范围刮树皮也会影响树势，造成不良后果，所以要从幼树开始预防苹果枝干轮纹病。戊唑醇是生产上常用的内吸性杀菌剂之一，试验证明戊唑醇对苹果枝干轮纹病具有很好的防治效果，刮除病斑施药防治效果可达到98%以上，不刮除病斑的防效也可达到90.00%以上。所以，为了节省劳力、降低树体损伤，施用戊唑醇防治苹果枝干轮纹病可不刮树皮或者轻刮皮，喷药时一定要均匀仔细，使所有枝干接触药剂。本试验中刮除病斑后立即涂抹腐愈灵和菌清进行保护，可以抑菌、保护伤口、促进伤口的愈合，将刮树皮的伤害降到最低，并高效的防治了枝干轮纹病，二者的防治效果分别为97.55%和95.65%。在防治试验中应注意果园卫生，对防治过程中刮除的轮纹病瘤、病斑及病皮清出果园或进行集中火烧或深埋处理，彻底铲除菌源[26,90]。32 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁根据河北省苹果枝干轮纹病田间发生状况的调查和几种药剂对苹果枝干轮纹病的防治效果试验结果，结合前人和果农的防治经验，对河北省苹果枝干轮纹病的防控提出以下几点建议：（1）选择抗病栽培品种或选用抗性砧木可预防或减轻苹果枝干轮纹病的危害。（2）注意加强苗木病害防治，培育无病壮苗。要注意强化苗期对轮纹病的防治，提高苗木质量，杜绝带病苗木的流通。（3）加强果园栽培管理，包括合理的修剪、施肥灌水和花果管理等，以不断增强树势，提高树体本身的抗病能力。（4）注意果园卫生。在控制伤口大小、不影响树势的情况下，刮除枝干上的病瘤和病斑，然后涂抹愈合剂或喷杀菌剂抑菌，保护伤口、促进伤口的愈合。并将刮除的病组织和病残体清出果园，可进行深埋或火烧处理，彻底铲除菌源。（5）在化学防治方面，要选取多种安全有效的药剂，如戊唑醇、树安康和波尔多浆等，各药剂轮换交替使用效果更好，可防止轮纹病菌产生抗药性。药剂涂干也是重要的防治措施，利用腐愈灵、菌清和波尔多浆等涂干可以抑菌、促进伤口愈合，刮树皮后涂干效果更佳；腐轮4号在入冬前涂干，不仅可以杀菌，防止病菌侵入在树体越冬，还可以防止冻害的发生。4.3抗轮纹病苹果砧木的茎尖培养快速繁殖体系的建立外植体材料接种成活受多种因素的影响[51-52]，如材料的种类、质量、消毒处理时间和启动培养基配方等。外植体褐变和真菌污染是影响苹果砧木外植体材料成活的两个重要问题，所以外植体材料消毒处理时间应综合考虑二者的影响，使外植体材料的褐变率和真菌污染率同时控制在较低水平。试验证明1-1-10-8砧木外植体材料最适消毒时间为10min，外植体污染率和褐变率较低，分别为10.00%和25.0%，外植体接种成活率高，为65.0%。J35-8砧木外植体材料升汞处理10min的消毒效果也较好。苹果苗在组织培养中很容易出现褐变现象，取材时期、消毒时间和激素水平[67]等都会影响褐变现象的发生，是影响外植体诱导成活的重要因素。据报道[69-70]通过低温预处理、调整激素水平、加入抗氧化剂或吸附剂措施等可减轻组培苗褐变的危害。本试验中对外植体材料进行水培处理和低温预处理，以及用无菌滤纸片吸去外植体表面的水分等措施可减少组织氧化褐变。本试验筛选出的适宜于苹果抗轮纹病砧木J35-8诱导成活、继代繁殖的培养基中的激素配比可有效抑制褐变，有利于外植体材料的生长发育。经试验，在培养基中加入1g/L的活性炭粉末可吸附有害物质，减轻外植体褐变的程度。33 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文组培苗玻璃化现象是组织培养过程中的重要障碍之一。本试验中两种砧木在组织培养过程中发现砧木J35-8容易发生玻璃化现象，而砧木1-1-10-8未出现玻璃化苗，证明不同材料受玻璃化危害的程度不同。此外，玻璃化苗的产生还可能是多种因素综合作用的结果[76,91]，如培养环境温湿度、培养基激素水平、铵离子浓度、琼脂浓度、封口材料的透气性等。试验发现当苹果砧木J35-8继代培养基的激素浓度配比不适宜时也很容易出现玻璃化苗，严重影响组培材料的繁殖速率。本试验中，6-BA浓度在0.5~1.5mg/L范围内，继代苗玻璃化程度随6-BA浓度升高而加重，但6-BA浓度为0.5mg/L时的玻璃化率与1.0mg/L的无显著差异，6-BA1.5mg/L时，继代苗的玻璃化率高达30.00%左右，显著高于浓度为0.5mg/L和1.0mg/L时。试验得出的适宜于继代培养的培养基激素配比6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L，发生玻璃化的几率也较小。组培苗的继代繁殖是生根前的重要工作，要为生根提供尽可能多的健壮一致、有活力的生根苗，使其能尽快适应生根培养，有利于壮苗的培育和移栽成活。所以筛选继代增殖培养基时，组培苗的生长状态与增殖系数、分枝高度同等重要，应该综合考虑。继代培养基筛选试验中，处理5的分枝高度最高，但增殖系数不如处理4高，且茎叶长势较处理4弱，玻璃化率也略高于处理4。所以选择处理4的培养基配方为最佳继代培养基。试验观察发现，苹果砧木1-1-10-8外植体材料接种成活后转至继代培养基中继代苗茎明显变细，但组培苗生长旺盛，增殖系数较高，组培苗生根和移栽成活不受影响。该现象可能与材料本身的遗传特性有关，也可能与激素配比有关，有待进一步研究证实。组培苗生根处理中，砧木J35-8的个别处理中有些继代苗在接入生根培养基后一周左右出现了叶片黄化的现象，分析原因可能是生根培养基中的营养物质减半，而生根材料尚未长根，不能吸收足够的组培苗生长所需的营养而造成的缺素症。而生根培养基为1/2MS+IAA1.0mg/L+IBA0.3mg/L的处理中未发现此现象，可能此培养基有利于苹果砧木J35-8生根，且生根早于其他处理，有待于进一步观察证实。34 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁5结论1.河北省苹果枝干轮纹病普遍发生且病情严重；不同品种苹果枝干轮纹病发生轻重程度不同；随着树龄的增高，果树受枝干轮纹病的危害程度也逐渐加重。2.本试验中的6种药剂均可用于防治苹果枝干轮纹病，各药剂对轮纹病菌菌丝生长都有较高的抑制效果，抑菌率均高于90.00%；刮除病斑后施药处理的田间防治效果优于不刮病斑直接施药的处理。3.抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8和J35-8的外植体经0.1%升汞消毒处理10min，褐变率和污染率低，有利于外植体材料成活；适宜于两种抗轮纹病苹果砧木外植体启动培养的培养基配方为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L；适宜于抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8和J35-8继代增殖的培养基分别为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.075mg/L和MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L；最适合于两种砧木组培苗生根的培养基分别为1/2MS+IAA1.0mg/L+IBA0.6mg/L和1/2MS+IAA1.0mg/L+IBA0.3mg/L。35 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文参考文献[1]束怀瑞等.苹果学[M].北京:中国农业出版社,1999.[2]李志霞,聂继云,李静,等.我国苹果产业发展分析与建议[J].中国果树.2014(5):81-84.[3]国家统计局农村社会经济调查司.中国农村统计年鉴2013[M].北京:中国统计出版社,2013.[4]康玲,郝红梅,杨振英,等.苹果轮纹病研究进展[J].中国农学通报.2009,25(09):188-191.[5]国立耘,李金云,李保华,等.中国苹果枝干轮纹病发生和防治情况[J].植物保护,2009,35(4):120-123.[6]梁魁景,王树桐,曹克强.河北省苹果主要病虫害发生现状调查[J].植物保护,2010,36(5):123-127.[7]唐唯,国立耘.中国苹果轮纹病病原的研究[C].中国植物病理学会2009年学术年会论文集,2009:194.[8]宋理想.苹果轮纹病无公害防治技术[J].山西果树,2011,4(7):28-29.[9]曹克强,王春珠,耿硕.我国苹果主要病虫害及其防治策略[J].河北农业科学,2010,14(8):72-74,81.[10]杨军玉,王亚南,曹克强,等.2011-2012年全国苹果病虫害发生概况和用药情况统计分析[J].北方园艺,2013(12):124-127.[11]曹若彬.果树病理学[M].第3版.北京:中国农业出版社,2002.[12]王国平,窦连登.果树病虫害诊断与防治原色图谱[M].第1版.北京:金盾出版社,2002.[13]阎振立,张全军,张顺妮,,等.苹果品种对轮纹病抗性的鉴定[J].果树学报,2005,22(6)：654-657.[14]张愈学,沈永波,蒋明三,等.苹果轮纹烂果病的研究发生规律及防治[J].北方果树,1996(2):8-12.[15]张建国.果树抗病性研究概况[J].中国果树,2003(2):47-49.[16]陈建中,盛炳成,刘克钧.苹果品种对轮纹病菌皮孔侵染的抗性机制[C].中国科协第二届青年学术年会园艺学卫星会议论文集.北京:北京农业大学出版社,1995.[17]刘志.苹果抗轮纹病种质资源和基因筛选以及NO介导的防御影响[D].山东:山东农业大学,2009.[18]王晔,胡同乐,曹克强.生长季苹果枝干轮纹病病菌分生孢子释放的决定性因素[J].安徽农业科学,2010,38(27):15002-15004.[19]高艳敏,沈永波,张恩尧,等.苹果轮纹病发生规律及条件的研究[J].安徽农业科学,2007,35(3):751-754.[20]武雅娟,周宝琴,叶春祥.富士苹果枝干轮纹病发生原因分析与综合防治[J].中国果树,2008(3)：64-66.[21]张新志.红富士苹果轮纹病发生趋重的原因及对策[J].山西果树,2009(1):35.[22]邓建平.砧木和营养水平对葡萄生长与抗病性的影响[D].2003.[23]杨华,崔元玗,孙晓军,等.茄子品种及嫁接砧木抗病性筛选及嫁接效果研究[R].中国河南鹤壁:公共植保与绿色防控--中国植物保护学会2010年学术年会,2010.[24]赵玲玲,宋来庆,李元军,等.抗轮纹病苹果砧木‘烟砧一号’抗病机理初探[J].园艺学报,2010,37(2):297-302.[25]吴小芹,何月秋,刘忠华.葡萄座腔菌属所致树木溃疡病发生与研究进展[J].南京林业大学学报,2001,25(1):61-65[26]宋哲,徐贵轩,高艳敏.苹果轮纹病综合防控技术[J].中国果树,2009(2):60-61,68.[27]王彦荣,胡同乐,曹克强.5种杀菌剂对苹果轮纹病病菌的室内毒力测定及田间药效试验[J].中国果树,2013(3),36 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河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文在读期间发表论文[1]陈晓洁,郭兴科,徐继忠,等.抗轮纹病苹果砧木J35-8茎尖培养快繁体系建立.北方园艺（已录用）[2]陈晓洁,李方方,徐继忠,等.几种药剂对苹果轮纹病菌抑菌力的测定及田间防治效果.西部林业科学（已录用）[3]陈晓洁,李方方,徐继忠,等.河北省苹果枝干轮纹病发生与防治状况.北方园艺（已录用）[4]陈晓洁,郑伶杰,徐继忠,等.抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8茎尖培养快繁体系建立.江苏农业科学（已录用）[5]白旭亮,郭兴科,陈晓洁,等.保定地区几个早熟苹果品种（系）生长结果表现初报.河南农业科学（已录用）40 河北省苹果枝干轮纹病发生状况及抗轮纹病苹果砧木的组培快繁作者简历姓名：陈晓洁性别：女出生日期：1989年3月籍贯：河北省张家口市涿鹿县最后学历：硕士研究生毕业院校：河北农业大学获得奖励：荣获校优秀毕业研究生发表论文：[1]陈晓洁,郭兴科,徐继忠,等.抗轮纹病苹果砧木J35-8茎尖培养快繁体系建立.北方园艺（已录用）.[2]陈晓洁,李方方,徐继忠,等.几种药剂对苹果轮纹病菌抑菌力的测定及田间防治效果.西部林业科学（已录用）.[3]陈晓洁,李方方,徐继忠,等.河北省苹果枝干轮纹病发生与防治状况.北方园艺（已录用）[4]陈晓洁,郑伶杰,徐继忠,等.抗轮纹病苹果砧木1-1-10-8茎尖培养快繁体系建立.江苏农业科学（已录用）.[5]白旭亮,郭兴科,陈晓洁,等.保定地区几个早熟苹果品种（系）生长结果表现初报.河南农业科学（已录用）.41 河北农业大学全日制专业硕士学位（毕业）论文致谢论文即将完稿，在此谨向我敬爱的老师、亲爱的同学和所有帮助过我的朋友们表示最诚挚的谢意！特别感谢我的导师徐继忠教授的培养和指导，让我顺利实现攻读硕士研究生的目标。本次论文从选题到完成，每一步都是在导师的悉心指导下完成的，导师付出了大量的心血和汗水。在写论文的过程中，遇到了很多的问题，在老师的耐心指导下，培养了我发现问题、分析问题和解决问题的能力，使得各种困难都得以解决。在此，谨向我的导师徐继忠教授表示崇高的敬意和衷心的感谢!恩师治学严谨，对工作兢兢业业，他渊博的知识，开阔的思维方式、独特的学术视角和严谨的科研态度，都深刻影响着我，是值得我终生学习的榜样。生活中恩师待人诚恳、平易近人，向父亲一样关心照顾我们，在此想对我的恩师道一声：“老师，感谢您！您辛苦了！”同时也很感谢马宝焜教授和张学英教授的支持和指导，感谢老师给予的关心、鼓励和深具启发性的建议。也要感谢李中勇老师和张媛老师一直以来的关心和帮助。攻读研究生期间所有学习和科研也离不开师兄师姐、同学、朋友的热情帮助，在这里请接受我诚挚的谢意！感谢师姐史娟、王淼淼、张佳俊和师兄郭兴科、郝建博和徐濛等，感谢同学白旭亮、李方方、郑伶杰、贾浩以及舍友齐敬伟、马青翠等，感谢师弟马宏、孟宏志、孙天骅等，感谢师妹杨利粉、赵晗霞等，感谢！我很庆幸在研究生期间遇到了如此多的良师益友，无论在学习上、生活上，还是工作上，大家都给予了我很多热心的帮助和无私的照顾，谢谢你们！感谢河北农业大学园艺学院和研究生学院为我们默默付出的老师们，衷心地祝福你们！感谢父母一直以来对我多年求学道路的关心和支持，正因为有您们做我坚强的后盾，让我能够全身心的投入到学习和科研工作中去，坚持不懈地走完我的求学之路，愿您们健康长寿！在毕业后的日子里，我也会更加努力的学习和工作，不辜负大家对我的殷殷期望！最后，衷心感谢在百忙之中抽出时间评审论文和提出宝贵意见的各位专家和教授！陈晓洁二〇一五年五月于保定42