狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价

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1、中文摘要狂犬病病毒样颗粒的构建、制备及免疫效果评价狂犬病是重要的人兽共患传染病，包括人在内几乎所有哺乳动物均易感。狂犬病在超过150个国家和地区发生，每年致超过5500人死亡，95%人类死亡病例发生在非洲和亚洲，这些地区犬类狂犬病潜在威胁超过30亿人。狂犬病由狂犬病病毒（rabiesvirus,RABV）感染所致，RABV具嗜神经性，感染中枢神经系统，病死率近乎100%。狂犬病是疫苗可防控的疾病，预防人类狂犬病最为经济有效的策略就是通过疫苗免疫消除犬狂犬病，大部分发达国家，通过犬只大规模疫苗接种消除了犬狂犬病，

2、进而显著降低人类狂犬病发病数。因此，安全、有效、经济适用的狂犬病疫苗是十分重要的。病毒样颗粒（virus-likeparticle,VLP）是由病毒的一种或几种结构蛋白在体外以自主装配方式形成的一种粒子，形态和结构上模拟天然病毒，不含遗传物质，无感染和复制能力。VLP以正确构象和高度重复的形式展示抗原表位，具有良好免疫原性，同时诱导体液和细胞免疫，为宿主提供抵御病原微生物感染的能力。VLP已成为众多病原微生物新型疫苗的研究热点，流感VLP疫苗、乙型肝炎VLP疫苗等已进入临床试验或批准上市。但目前为止，有关狂犬病

3、病毒样颗粒（rabiesVLP）构建研究的报道却是极少的。因此，本论文利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产rabiesVLP，并对其免疫原性进行研究。第一章：狂犬病病毒样颗粒的构建与制备。RABV糖蛋白（glycoprotein,GP）是唯一刺激并诱导机体产生病毒中和抗体（virusneutralizingantibody,VNA）的结构蛋白，基质蛋白（matrixprotein,MP）决定了RABV合成、出芽，维持病毒形态，且MP上具有GP专一性结合位点，影响GP在病毒包膜表面的构象。因此，本研究选择RABV

4、Evelyn-Rokitnicki-Abelseth（ERA）株GP和MP作为构建rabiesVLP基本组装元件。构建并拯救分别表达GP和MP的重组杆状病毒（recombinantbaculovirus,rBV），共感染悬浮培养Sf9细胞，收获上清并经蔗糖密度梯度离心纯化rabiesVLP。电镜观察可见大小在180~200nm、纤突明显的圆形或椭圆形rabiesVLP，WesternBlot分析显示rabiesVLP由GP和MP组成，免疫电镜检测证实rabiesVLP表面纤突为GP。成功构建并生产出由RABVI

5、ERA株GP和MP装配形成的rabiesVLP，命名为EVLP。第二章：嵌合型狂犬病病毒样颗粒的构建与制备。鞭毛蛋白（flagellin）作为Toll样受体（toll-likereceptor,TLR5）5天然激动剂，有效诱导天然免疫，触发B细胞和T细胞参与的适应性免疫。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基（LTB）与神经节苷脂GM1高度亲和，增强抗原提呈能力，诱导淋巴细胞增殖与分化，提高机体免疫应答。因此，本研究选择flagellin和LTB作为rabiesVLP膜锚定形式的分子佐剂。分别构建含GP跨膜区和胞质尾区的f

6、lagellin和LTB融合基因，拯救分别表达flagellin和LTB融合基因的两株rBV，并以分别表达GP、MP和flagellin或LTB的三种rBV共感染悬浮培养Sf9细胞，收获上清并蔗糖密度梯度离心纯化两种嵌合型rabiesVLP。电镜观察可见大小在180~200nm、纤突明显的圆形或椭圆形嵌合型rabiesVLP，WesternBlot分析显示两种嵌合型rabiesVLP由GP、MP和flagellin或LTB组成，免疫电镜检测证实flagellin和LTB分别成功插入两种嵌合型rabiesVLP。

7、成功构建并生产出由RABVERA株GP、MP和flagellin或LTB装配形成的两种嵌合型rabiesVLP，分别命名为EVLP-F和EVLP-L。第三章：狂犬病病毒样颗粒免疫效果评价。通过肌肉注射免疫小鼠和犬，评价EVLP、EVLP-F和EVLP-L免疫效果以及是否具有开发成新型狂犬病疫苗的潜能。小鼠免疫显示，三种rabiesVLPs均具有免疫原性，但与EVLP相比，EVLP-F和EVLP-L诱导更快更强的VNA反应，触发显著增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞；两种嵌合型rabies

8、VLP免疫后在腹股沟淋巴结募集和/或活化更多的B细胞和树突状细胞（dendriticcell,DC）；EVLP-F诱导产生强大的特异性IgG2a抗体反应，活化倾向于Th1型免疫应答；与之相反，EVLP-L触发更倾向于IgG1血清抗体反应；EVLP免疫仅保护部分小鼠免受RABV致死性攻击，而EVLP-F和EVLP-L所诱导显著增强的体液和细胞免疫应答为小鼠提供完全保护用于抵抗RABV感染