含SARSCoVRNA病毒样颗粒的构建和表达

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时间:2019-05-11

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1、含SARSCoVRNA病毒样颗粒的构建和表达作者:李振勇,景建洲,刘明霞,邵大晓,冯艳铭,李智涛,宋国英,王秋旗,王云龙,屈凌波,赵玉芬【关键词】病毒样颗粒  【Abstract】AIM:ToconstructandexpressRNaseresistantviruslikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoV.METHODS:TheprimersofMS2assemblyproteingene,coatproteingeneandthefrag

2、mentofSARSCovRNApolymerasegeneweresynthesizedaccordingtotheirsequencesfromGenbankdataandwereusedtoamplifytheircDNAsbyRTPCR.ThesecDNAswerepurifiedwithSABCsResincolumTMsystemforDNApurificationfromagarosegel.ExpressionvectorpTrc99aandtheircDNAfragmentsw

3、ereligatedtogetherwithT4DNAligaseafterdigestionwithrestrictionenzymes.TheprokaryoticexpressionwasobtainedbythetransformationoftherecombinantplasmidconstructedaboveintoE.coliJM109.Theobtainedviruslikeparticleswerepurifiedandtestedbyquantitativeanalysi

4、s,RTPCRandstableexperiment.RESULTS:TheRNaseresistantviruslikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoVwassuccessfullyconstructedandremainedstablefor30daysat37℃.CONCLUSION:Thenewtypeviruslikeparticlescan9beconvenientlyusedaspositivecontrolofSARSclin

5、icalnucleicdiagnosticreagents.  【Keywords】SARS;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;RNA,viruslikeparticles;ribonucleases  【摘要】目的:构建并表达含有SARS冠状病毒RNA片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒.方法:通过克隆大肠杆菌噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因以及SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段,将这些基因连接到载体pTrc99a上表达,并进行纯化、定量分析

6、、RTPCR检测和稳定性试验.结果:获得病毒样核蛋白颗粒,在37℃稳定性可达到30d,能抵抗核糖核酸酶降解.结论:该病毒样核蛋白颗粒稳定、安全、可靠,可作为SARS冠状病毒RTPCR检测、定量分析的有效阳性参考品.  【关键词】SARS;逆转录聚合酶链反应;RNA,病毒样颗粒;核糖核酸酶类  0引言  200211/200306SARS[1,2]在全球流行,对全球尤其我国的经济发展带来了巨大影响,但在科技人员的努力下,很快研制成功了快速、准确的SARS病毒基因检测试剂.临床检测中人们普遍关心的是

7、检测试剂盒中使用的阳性参考品是否具有传染性、或者能否起到阳性全程参比的作用.因此,研制稳定、无传染性的阳性参考品尤为重要.我们根据Drosten&9Collahan等[3,4]报道的方法,制备了含有SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段的抗核糖核酸酶病毒样核蛋白颗粒.该病毒样颗粒能有效抵抗RNase引起的RNA降解,能作为SARS冠状病毒基因检测的阳性参考品,对SARS基因检测起到有效的全程监控作用.  1材料和方法  1.1材料  ①灭活的SARS冠状病毒样本由RobertKochIns

8、titut(德国)提供,MS2噬菌体(ATCC15597B1)购于美国ATCC;②试剂:MLV反转录酶(Promega),dNTP(Pharmacia),TaqDNA聚合酶(华美生物工程公司),引物和荧光探针(上海生工公司合成),其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂;③RNA提取试剂由华美生物工程公司提供;④SARS荧光PCR定量检测试剂盒由华美生物工程公司提供.扩增仪器用美国PE公司的PE7700荧光扩增仪.  1.2方法  1.2.1基因合成根据Genbank数据库中的基因序列,设计合成大肠

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