含sars cov rna病毒样颗粒的构建和表达

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1、含SARSCoVRNA病毒样颗粒的构建和表达【关键词】病毒样颗粒　　【Abstract】AIM:ToconstructandexpressRNaseresistantviruslikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoV.METHODS:TheprimersofMS2assemblyproteingene,coatproteingeneandthefragmentofSARSCovRNApolymerasegeneGenbankdataandplifythei

2、rcDNAsbyRTPCR.ThesecDNAsTMsystemforDNApurificationfromagarosegel.ExpressionvectorpTrc99aandtheircDNAfragmentses.TheprokaryoticexpressionationoftherebinantplasmidconstructedaboveintoE.coliJM109.Theobtainedviruslikeparticlesent.RESULTS:TheRNaseresistantvirusl

3、ikeparticlescontainingtheRNAfragmentsofSARSCoVainedstablefor30daysat37℃.CONCLUSION:Theneerasechainreaction;RNA,viruslikeparticles;ribonucleases　　【摘要】目的：构建并表达含有SARS冠状病毒RNA片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒.方法：通过克隆大肠杆菌噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因以及SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段，将这些基因连接到载体pTrc99a上表达，并

4、进行纯化、定量分析、RTPCR检测和稳定性试验.结果：获得病毒样核蛋白颗粒，在37℃稳定性可达到30d，能抵抗核糖核酸酶降解.结论：该病毒样核蛋白颗粒稳定、安全、可靠，可作为SARS冠状病毒RTPCR检测、定量分析的有效阳性参考品.　　【关键词】SARS；逆转录聚合酶链反应；RNA，病毒样颗粒；核糖核酸酶类　　0引言　　200211/200306SARS［1,2］在全球流行，对全球尤其我国的经济发展带来了巨大影响，但在科技人员的努力下，很快研制成功了快速、准确的SARS病毒基因检测试剂.临床检测中人们普遍关心

5、的是检测试剂盒中使用的阳性参考品是否具有传染性、或者能否起到阳性全程参比的作用.因此，研制稳定、无传染性的阳性参考品尤为重要.我们根据DrostenCollahan等［3,4］报道的方法，制备了含有SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段的抗核糖核酸酶病毒样核蛋白颗粒.该病毒样颗粒能有效抵抗RNase引起的RNA降解，能作为SARS冠状病毒基因检测的阳性参考品，对SARS基因检测起到有效的全程监控作用.　　1材料和方法　　1.1材料　　①灭活的SARS冠状病毒样本由RobertKochInstitut（德国）提供

6、，MS2噬菌体（ATCC15597B1）购于美国ATCC;②试剂：MLV反转录酶（Promega）,dNTP(Pharmacia),TaqDNA聚合酶（华美生物工程公司）,引物和荧光探针（上海生工公司合成）,其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂;③RNA提取试剂由华美生物工程公司提供;④SARS荧光PCR定量检测试剂盒由华美生物工程公司提供.扩增仪器用美国PE公司的PE7700荧光扩增仪.　　1.2方法　　1.2.1基因合成根据Genbank数据库中的基因序列，设计合成大肠杆菌噬菌体MS2装配蛋白和壳蛋白基因

7、引物：MSUP（5′atgaattctcctgctcaacttcctgtcg3′）与MSDOLV反转录酶、50URNA酶抑制剂、1×反转录缓冲液、N6随机引物，37℃孵育60min.PCR反应体系中含有20pmol引物、1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP和3UTaqDNA聚合酶，10μL反转录产物，反应参数是94℃预变性5min,然后94℃1min，55℃1min，72℃3min,进行35个循环，最后在72℃延伸5min［5］.　　1.2.2cDNA纯化用PCR产物纯化试剂盒，并将cDN

8、A悬浮在TE缓冲液中备用.　　1.2.3cDNA片段克隆表达将表达载体pTrc99a（Pharmacia）和MS2的cDNA片段用EcoRⅠ/HindⅢ双酶切，SARS的cDNA片段用HindⅢ单酶切.消化反应体系中含有10U的EcoRⅠ,10U的HindⅢ,1×内切酶缓冲液，37℃孵育60min.连接反应体系包括1U的T4DNA连接酶、基因片段、1×连接缓冲液，12℃孵育2h.按照CaCl2方法将