抑制素a对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响

《抑制素a对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中文摘要抑制素A对猪卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响抑制素（inhibin）是由雌性动物卵巢和雄性动物睾丸分泌的糖蛋白异二聚体，属于TGFβ超家族一员，α(INHA)和βA（INHβA）亚基构成抑制素A，α和βB(INHβB)形成抑制素B。在雌性动物体内，抑制素主要通过内分泌途径抑制垂体合成和分泌FSH，调节卵泡发育、配子发生和激素分泌。在卵巢局部，抑制素还可以通过自分泌和旁分泌作用调节卵母细胞-颗粒细胞同步发展。动物发情周期中，外周血液抑制素水平可以反应出卵巢上生长卵泡的数量，是决定动物卵泡发育和排卵的关键因素。目前关于抑制素对动物生

2、殖影响的研究主要集中在利用抑制素进行动物免疫实验，而对细胞增殖、凋亡影响的研究则主要集中在生殖肿瘤细胞上。抑制素对不同动物或细胞的激素分泌影响不一致，对家畜卵母细胞成熟研究较少，尤其在猪的研究尚未见报道。本研究以成年猪卵巢为材料，以卵泡颗粒细胞和卵母细胞为研究对象，进行卵泡颗粒细胞体外培养、卵母细胞体外成熟、孤雌激活和早期胚胎发育等一系列实验，探讨抑制素A对猪卵泡颗粒细胞类固醇激素合成、颗粒细胞增殖、凋亡、卵母细胞成熟的影响，另外还研究抑制素α亚基基因多态性与猪卵泡囊肿之间的联系。研究内容主要有以下几个方面：1.抑制素A对卵泡颗粒细胞类固醇激素

3、合成的影响本研究分离猪卵泡颗粒细胞，利用FSHR进行免疫荧光实验对分离的细胞进行鉴定。免疫荧光结果显示：分离得卵泡颗粒细胞纯度在90%以上，满足后续实验要求。然后分别使用不同浓度（0、10、100、200ng/mL）的人源重组抑制素A和400ng/mL的抑制素α抗体处理体外培养的猪卵泡颗粒细胞，处理时间分为4个梯度，即12、24、48和72h。处理结束后提取RNA进行荧光定量。荧光定量结果显示，200ng/mL的抑制素A处理颗粒细胞48h，显著增加了颗粒细胞内FSHR、LHR、CYP11a1和STAR基因mRNA的表达(p<0.05)。ELIS

4、A方法检测细胞培养上清中孕酮和雌二醇的浓度，结果显示，200ng/mL抑制素A作用48h显著提高了颗粒细胞中雌二醇的合成及分泌（p<0.05）。200ng/mL抑制素A处理颗粒细胞24h-48h可以显著抑制孕酮的分泌(p<0.05)，72h则表现为促进作用（p<0.05）。2.抑制素A对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响为了研究抑制素A对卵泡颗粒细胞增殖、凋亡的影响，在猪卵泡颗粒细胞体外培养过程中添加不同浓度（0、20、50、100ng/mL）的人源重组抑制素A处理颗粒细胞24h，MTS检测细胞活力，结果显示：高浓度（50、100ng/mL）的抑制素

5、A可以显著提高颗粒细胞活力(p<0.05)，并I且呈剂量依赖效应。利用JC-1方法检测线粒体膜电位，发现100ng/mL抑制素A处理48h可以显著提高线粒体膜电位。之后，我们研究了抑制素A对颗粒细胞增殖、凋亡基因表达影响，分别利用不同浓度（0、10、100、200ng/mL）的抑制素A处理颗粒细胞12、24、48、72h，提取RNA后进行荧光定量。结果显示：抑制素A处理48h可以促进增殖基因PCNA、CCNB1的表达，抑制凋亡基因Caspase-3表达（p<0.05），并且呈剂量依赖效应。细胞周期检测发现，与对照组比较，200ng/mL的抑制素

6、A处理48h可以显著提高S期细胞比例（p<0.05）。利用RNA干扰方法沉默颗粒细胞内抑制素α亚基基因表达，细胞内Caspase-3基因的表达量升高，而细胞周期蛋白CCNB1基因表达量则降低（p<0.05）。这些结果说明抑制素A可以促进颗粒细胞增殖，抑制其凋亡。3.抑制素A对卵母细胞体外成熟的影响为了研究抑制素A对猪卵母细胞体外成熟的影响，在卵母细胞体外成熟培养液中添加200ng/mL的抑制素A，结果发现，与对照组相比，抑制素A可以促进GV期GDF9、COX2基因的表达（p<0.05），并能够促进卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟。体外成熟液或胚胎发育

7、液中添加抑制素A，可以提高猪卵母细胞孤雌激活胚胎的卵裂率（p<0.05）,但是对囊胚率影响不显著（p>0.05）。4.抑制素α亚基基因多态性与猪卵泡囊肿之间的联系利用PCR-SSCP与PCR-RFLP方法，检测患有卵泡囊肿母猪和正常母猪抑制素α亚基基因c.-42G>A和c.3222G>A位点基因多态性与卵泡囊肿之间的联系。结果显示c.-42G>A和c.3222G>A多态性与卵泡囊肿存在联系（p<0.05），c.-42GG和c.3222GG基因型母猪患囊肿的风险较低。同时ELISA结果显示囊肿卵泡液中含有高浓度的抑制素A。综上所述，本实验证明抑制

8、素A能够促进体外培养的猪卵泡颗粒细胞类固醇激素合成分泌，促进颗粒细胞增殖。抑制素A还可以促进卵母细胞体外成熟，促进孤雌激活胚胎的卵裂，但是对早期胚胎发