牙鲆弹状病毒非结构蛋白（nv）的表达及抗原性初步分析

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1、分类号密级UDC编号硕士学位论文牙鲆弹状病毒非结构蛋白（NV）的表达及抗原性初步分析张小飞（1211032）指导教师姓名李华教授专业名称海洋生物学论文答辩日期2015年5月27日学位授予日期2015年7月MASTERDISSERTATIONProkaryoticexpressionofNon-virionproteinofHiramerhabdovirusandpreliminaryanalysisofitsantigeneicitySupervisor:Pro.LiHuaMastercandidat

2、e:ZhangXiaofeiCollegeofFisheriesandlifescience,DalianOceanUniversityJun2015摘要摘要牙鲆弹状病毒（Hiramerhabdovirus，HRV）是弹状病毒科粒外弹状病毒属新成员，具有强烈的致病性，给全球海水养殖业造成了严重的经济损失。病毒在入侵宿主细胞的过程中，宿主细胞通过模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PRRs）监测病原相关分子模式（pathogenassociatedmolecularpa

3、tterns,PAMPs）而感知病毒的入侵，并通过信号通路的级联传递，协调病毒感染早期宿主反应，并随即激活宿主获得性免疫反应。然而，通过和宿主的相互作用，RNA病毒进化出逃逸宿主RLRs免疫监视的不同策略来干扰宿主RLRs抗病毒信号，阻断RLRs信号的传导，从而导致宿主发病。多数情况下，病毒倾向于利用非结构蛋白进行此功能。而HRV致病机制及逃逸宿主免疫监视的分子机制还没有得到明确的阐述。本研究根据GenBank中HRV中国株全长基因序列设计特异性引物，用RT-PCR方法从病毒悬液中分段扩增HRV全长基

4、因组序列，得到的基因序列拼接后，经BLAST比对发现与中国株的同源性达到99.77%，为后续获得感染性克隆奠定基础。根据GenBank中HRV中国株非结构蛋白（Non-virionperotein，NV）基因序列设计特异性引物，用RT-PCR方法扩增NV基因，鉴定无误后连接到大肠杆菌pColdⅠ载体中，构建的重组表达质粒pColdⅠ-NV在大肠杆菌BL21（T1®）宿主菌中获得高效表达，表达产物以可溶性蛋白存在。经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得有活性的NV蛋白。以浓缩纯化的HRV作为抗原免疫Balb/

5、c小鼠，得到效价为1:51200的抗HRV多克隆抗体。Western-blot和ELISA试验结果表明，抗HRV多克隆抗体能特异性识别表达获得的HRVNV重组蛋白，证明NV重组蛋白抗原性良好。本实验成功获得有活性的NV蛋白，为研究牙鲆弹状病毒逃逸宿主免疫监视的机制奠定了实验基础。关键词：牙鲆弹状病毒；非结构蛋白；原核表达；抗原性分析IAbstractAbstractHiramerhabdovirus（HRV)isaNovirhabdovirusresultinginlethaldiseaseinwil

6、dandfarmedJapaneseounder(Paralichthysolivaceus)withasevereeconomiclossesinaquacultureindustry.Duringtheinvasionofthevirusinthehostcell,andtheperceivedinvasionofhostcellsbytheviruspatternrecognitionreceptorsmonitorpathogenassociatedmolecularpatterns,andp

7、assedthroughacascadeofsignalingpathways,coordinationviralinfectionearlyhostresponse,andthenactivatethehostacquiredimmunityreaction.However,bytheinteractionofRNAvirusesandhosts,RNAvirusesevolvedtoescapeimmunesurveillanceofthehostRLRsdifferentstrategiesto

8、interferewiththehostRLRsantiviralsignaling,blockingsignaltransductionRLRs,leadinghostdisease.Inmostcases,thevirustendedtouseNon-virionperoteintoescapeimmunesurveillanceofthehostRLRs.ButthemolecularmechanismsofHRVpathogenesisandho