重组人凝血因子ⅷ腺病毒载体的构建与鉴定

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1、硕士学位论文MASTER'SDISSERTATION论文题目重组人凝血因子Ⅷ腺病毒载体的构建与鉴定作者姓名王林学位类别化学工程指导教师韩增胜副教授2015年5月-I-中图分类号：Q782学校代码：10216UDC：57密级：公开工程硕士学位论文(技术研究型)重组人凝血因子Ⅷ腺病毒载体的构建与鉴定硕士研究生：王林导师：韩增胜副教授副导师：何会玉高级工程师申请学位：工程硕士工程领域：化学工程所属单位：环境与化学工程学院工作单位：唐山市丰南区住建局答辩日期：2015年5月授予学位单位：燕山大学-II-ADissertationinM

2、asterofEngineeringCONSTRUCTIONANDIDENTIFICATIONOFADENOVIRUSVECTORSCONTAININGRECOMBINANTHUMANCOAGULATIONFACTORⅧGENEbyWangLinSupervisor:AssociateProfessorHanZengshengYanshanUniversityMay,2015-III-燕山大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：此处所提交的硕士学位论文《重组人凝血因子Ⅷ腺病毒载体的构建与鉴定》，是本人在导师指导下，在燕山大学攻

3、读硕士学位期间独立进行研究工作所取得的成果。论文中除已注明部分外不包含他人已发表或撰写过的研究成果。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。作者签字：日期：年月日导师签名：日期：年月日燕山大学硕士学位论文使用授权书《重组人凝血因子Ⅷ腺病毒载体的构建与鉴定》系本人在燕山大学攻读□士学位期间在导师指导下完成的□士学位论文。本论文的研究成果归燕山大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人完全了解燕山大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送

4、交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权燕山大学，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文，可以公布论文的全部或部分内容。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上相应方框内打“√”）作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日-IV-摘要摘要人凝血因子Ⅷ基因的遗传缺陷将会所引起凝血系统的紊乱，这种单基因遗传病被称为血友病。本文针对A型血友病目前替代法治疗上的不足之处，试图构建一种用于A型血友病的基因治疗载体。研究基于AdEasy重组病毒载体构建系统，首先利用分子克隆方法，获取了人源性凝

5、血因子Ⅷ基因序列，并对获得的基因片段序列进行了测序验证分析，亚克隆至穿梭质粒载体pShuttle，为了实验研究便于示踪，将最初来源于水母的绿色荧光蛋白基因编码序列引入穿梭质粒载体。通过构建含有CMV启动子的表达载体，介导凝血因子Ⅷ基因和绿色荧光蛋白基因在后续细胞里进行共同转录和翻译。含有hFⅧ-GFP片段的重组质粒与含有Ad5腺病毒基因组DNA的pAdEasy-01载体在大肠杆菌菌株中完成重组。经连接反应、转化反应、碱裂解法抽提质粒、限制性内切酶消化分析及琼脂糖凝胶电泳法等，最终获得了含有凝血因子Ⅷ基因的腺病毒载体pAd-hF

6、Ⅷ。在上述质粒载体构建成功的基础上，将pAd-hFⅧ以限制性内切酶PacI线性化，然后，利用脂质体转染法，在HEK293细胞里培养包装病毒。经7~10天细胞病毒培养，对细胞内病毒初始液进行了分子检测与分析，获得了含有目标基因的阳性DNA条带。同时，利用免疫印记杂交技术，在经重组病毒载体感染生长的细胞培养物中，检测到凝血因子hFⅧ的免疫活性。本实验研究获得的重组人凝血因子Ⅷ基因载体可为A型血友病基因治疗的应用研究提供参考材料。关键词：A型血友病；人凝血因子Ⅷ基因;基因治疗；Ad5型腺病毒载体；基因载体构建-V-燕山大学工程硕士学

7、位论文AbstractThegeneticdefectofhumancoagulationfactorVIIIgenewillcausethedisorderofcoagulationsystem.Thissinglegenedisorderknownashemophilia.AimingattheshortcomingsofthecurrentmethodofhemophiliaAalternativetreatment,trytoconstructavectorforgenetherapyforhemophiliaA.St

8、udyonconstructionofrecombinantvirusvectorsystembasedonAdEasy,Firstly,usingmolecularcloningmethods,obtainedthesequenceofcoagulationfactorVI