鸽ⅰ型副黏病毒pl分离株f基因克隆与dna疫苗研究分析

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1、...页眉鸽Ⅰ型副黏病毒PL分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究摘要：根据GenBank报道的鸽Ⅰ型副黏病毒F基因序列设计了一对引物，以鸡新城疫病毒PL分离株基因组为模板，通过RT-PCR扩增出了1.66kb左右的F基因片段，序列分析表明PL株F基因与国内外17株鸽Ⅰ型副黏病毒或鸡新城疫F基因核苷酸序列的同源性为76.3-98.6%。将PL株F基因插入真核表达载体PCDNA3.1V5HIS中，构建了真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F，将构建的真核表达重组质粒免疫1月龄非免疫新城疫的乳鸽，剂量为100μg/羽，2周后加强免疫1次，并在免疫后0d、7d、14d、21d、28

2、d翼下静脉采血分离血清，用间接ELISA分别检测各组血清抗体，ELISA检测结果表明：真核表达质粒免疫乳鸽后产生的抗体与鸽Ⅰ型副黏病毒F蛋白发生特异性反应，在免疫第7d开始有抗体产生，在免疫14d抗体水平达到最高，之后抗体水平开始下降，说明F蛋白具有很好的免疫原性。以真核表达重组质粒免疫乳鸽第28天以100倍鸡胚半数感染剂量(EID50)的F基因同源病毒对所有乳鸽进行攻毒。结果显示重组质粒免疫组和鸽新城疫蜂胶灭活苗免疫组的免疫保护率分别为33.3%和100%，显著高于生理盐水组和PCDNA3.1V5HIS空载体组，鸽新城疫蜂胶佐剂灭活苗组的免疫保护率也显著高于重组质粒组。表明所构建的

3、F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导乳鸽产生免疫保护反应，但还需其他方法来提高其免疫效率。关键词：鸽Ⅰ型副黏病毒；F基因；克隆；鸽Ⅰ型副黏病毒(PigeonParamyxovirus1,PPMV-Ⅰ)病又称鸽瘟或鸽新城疫，是一种由禽Ⅰ型副黏病毒(AvianParamyxovirus1,PMV-Ⅰ)引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，它以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，是危害养鸽业的主要疫病之一[1,2]。有资料记载，1952年Hanson和Sinha首先在PoultryScience杂志上报道了鸽的一种类似鸡新城疫的疾病，此后Ahmed和Sabri(1969)，Stewar

4、t(1971)，Hilbrich(1972)，Vindevogel等(1972)，Maes等(1974)以及Canic(1981)先后有报道[3,4]....页脚...页眉。但是，后来经过血清学及分子水平研究确诊并为大多数学者公认的鸽I型副粘病毒首例报道是1977年发生在伊拉克的鸽Ⅰ型副黏病毒疫情。不过，当时一些学者认为是由疱疹病毒引起，他们称之为鸽疱疹性脑脊髓炎病毒，Schrag则认为是A/PMV-3[5,6]。1981年，苏丹，埃及又爆发疫情，从此疫情很快扩散波及到地中海国家，随之进入法国和德国[5]，随后迅速传播到欧洲、美国、加拿大等地[1-3]，到1985年已传播到亚洲。在1

5、986年前后，我国的鸽群中也发现了该病[7]，现流行全国各省市[8,9]。鸽Ⅰ型副粘病毒对不同品种、不同年龄的鸽都有感染性，传播迅速，死亡率高。目前防治鸽Ⅰ型副粘病最有效的方式是注射疫苗，但针对鸽Ⅰ型副粘病的疫苗市场很少见，主要用鸡新城疫（ND）疫苗防治鸽Ⅰ型副粘病，虽然PPMV-1与NDV存在较高的交叉反应，不少学者也认为新城疫疫苗能预防鸽Ⅰ型副粘病毒感染，但在生产实践中这种免疫效果常不够确实、有效。目前，治疗该病尚无特效药，许多研究人员都在致力于研究一种有效的疫苗或药物防治此病，加大鸽Ⅰ型副粘病病毒新型疫苗的研发力度成为鸽新城疫防治的当务之急。PPMV-1具有与NDV相似的特性，

6、病毒表面的血凝素和神经氨酸酶(HN)能凝集鸡和某些哺乳动物红细胞，这种凝集作用可被特异性血清所抑制。病毒的基因组为一条单股负链RNA，长约15kb，包括6个基因：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,其中F基因所编码的融合蛋白在病毒对细胞的穿透、溶血及细胞与细胞之间的融合方面起主要作用,决定病毒毒力的主要因素[10]，可以作为研制亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗的候选基因。....页脚...页眉上世纪80年代末，国内开始新城疫重组DNA基因工程疫苗的研制，在亚单位疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗方面的研究。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内,并

7、通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，而且具有安全可靠、制备简单、同种异株交叉保护、可产生持久免疫等优点，核酸疫苗被认为是继灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗之后的第三代疫苗。本研究克隆了鸽Ⅰ型副黏病毒PL株F基因，构建了真核表达质粒PCDNA3.1-PPMV-1-F，并对其免疫保护性进行了初步研究。1.材料与方