鸡新城疫病毒ndxx08株分离鉴定与f、hn基因的克隆与分析

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1、河南农业大学2010年毕业论文摘要鸡新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)弓I起禽的一种高度接触性、急性败血性传染病。新城疫是威胁世界养禽业的主要疾病之一，被世界动物卫生组织(OIE)归为列表疫病。新城疫病毒几乎可感染全部鸟类，并可随侯鸟的迁徙而广泛传播，NDV属于副黏病毒科、副黏病毒亚科的腮腺炎病毒属，单股负链RNA病毒。我国长期以来普遍开展了以接种疫苗为主的新城疫综合防制措施，很好控制了ND的暴发，但近年来ND的流行又出现了新的

2、特点：非典型新城疫日益增多，甚至高抗体鸡群也发生该病，这些流行特点很可能是由变异或超强毒株引起。近年来鹅源病毒新城疫变异株的出现使人们对于非典型新城疫发病原因的尤为感兴趣。本研究在2008年从新乡某鸡场不表现典型ND症状且高抗体蛋鸡中分离到的一株新城疫野毒(NDVND-xx08株)，在对其进行生物学特性研究的基础上，扩增出其F和HN基因，并做了免疫保护试验，为探讨新城疫病毒是否发生变异和ND预防提供理论依据，为河南省NDV分子流行病学研究提供有益参考，丰富了我国ND分子流行病学特征，为制定控制ND方法提供重要

3、依据。首先对NDVND．xx08株进行了一系列生物学特性研究。SPF鸡胚接种培养后，经过试验鉴定，该分离株具有血凝性，且可被ND标准阳性血清所抑制和中和，不能被禽流感(H5，H9)标准阳性血清和EDS．76标准阳性血清所抑制，因此该分离株为新城疫病毒。该病毒的最小致死量病毒致死鸡胚的平均时间(MDT)为50h；1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数0CPI)为1．71；6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2．38：由此NDVND-xx08株确定属于NDV强毒型。其次分别设计了一对引物，Tdzol法提取

4、了其RNA，RT-PCR扩增出NDVND-xx08株F基因和FIN基因的全基因序列，并分别对两条基冈的核苷酸序列进行测定和分析，并对氨基酸序列进行了分析。用DNAStar软件对本研究毒株与国内外发表的一些有代表性的46株参考毒株的NDVF基因47nt-420nt区域进行同源性比较，绘制了基因进化树，分析其遗传变异关系。经测定NDVND-xx08毒株的F基因开放性阅读框架全长1662bp，共编码553个氨基酸，F蛋白的裂解位点为112R-R⋯QKR．F117。系统发育分析得出该分离株属于基因VlIe型，将其与国

5、内外发表的部分新城疫病毒毒株之间F基因核苷酸和氨基酸序列进行比较，其核苷酸序列的同源性在82．7％．97．8％之间，氨基酸同源性在87．5％．97．7％之间，与F48E9株的氨基酸同源性为91．5％，与Lasota，Clone30和V4株的同源性分别为88．1％，88．6％和88．3％。从分子水平上说明NDVND-xx08株为发生了一定程度变异的新城疫强毒株。NDVND-xx08毒株的HN基因开放性阅读框架全长l716bp，编码571个氨基酸，属于C群。它与其他24株的HN基因核苷酸序列同源性在80％．98．

6、4％。它与北京毒株(SRZ03)和江苏毒株(zjl)同源性较高，分别经测定为98．1％和98．4％。从基因进化树来看，该毒株与北京和江苏所分离的毒株同源性较近，基本上属于同一基因群；与Lasota和Clone30等疫苗株的同源性较远，属不同的基因群。ND-xx08株HN蛋白氨基酸序列与其他24株同源性在87．2％．98．2％，与Lasota和Clone30的同源性分别为88．2％和89．3％，同源性较低。最后用该毒株做河南农业大学2010年毕业论文了免疫保护性试验，分别将NDVND-xx08株尿囊液稀释10、

7、100、1000倍，将原尿囊液和3种稀释倍数的尿囊液按照常规方法灭活，并制成油乳剂抗原。将四种油乳剂抗原对鸡群免疫，研究其抗体增长规律。然后对免疫鸡群进行攻毒，观察各组抗原的保护率，筛选出效果较好的抗原免疫剂量。综合了抗体产生的情况和攻毒后的保护率，我们得出将NDVND．xx08株尿囊液稀释100倍是最好，免疫接种0．2ml既可达到较好的保护。2河南农业大学2010年毕业论文CloningandanalysisofFgeneandHNgeneofNewcastlediseasevirusND．xx08isol

8、ateSupervisor：ProfessorXuLanjuMasterCandidate：JiaWenkeABSTRACTNewcastledisease(ND)causedbyNewcastlediseasevirus(NDv)，isahighlycontagious，acutesepticinfectiousdisease．NDisamongthemostseriousdiseasethrea