肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除

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1、^naSOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文Si论文题目肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响•突触核蛋白的清除研究生姓名王媚瑕指导教师姓名刘春风专业名称神经病学研究方向帕金森病论文提交日期2015年03月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：王A/I艰曰期：yojX■苏州大学学位

2、论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被査阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年_月解密后适用本规定。非涉密论文□论文作者签名丨期：yn吨导师签名々^^日期：肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突

3、触核蛋白的清除中文摘要肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除中文摘要目的：研究肿瘤坏死因子(TNF)对α-突触核蛋白（α-synuclein）降解清除的影响，探讨自噬溶酶体通路在其中的作用和机制。方法：以高分化PC12细胞为工具细胞，以重组TNF或活化的小胶质细胞释放的TNF作用于PC12细胞作为模型。以细菌脂多糖（LPS）作用于BV2小胶质细胞并收集培养上清作为小胶质细胞条件性培养基，以ELISA检测条件培养基内TNF及IL-1β的含量；使用CCK8法检测细胞存活率；采用Westernblot方法检测α-synuclein蛋白、自噬标记蛋白LC3II、p62及溶酶体表面标志物

4、LAMP1等蛋白的表达变化；利用瞬时转染方法的方法构建PC12细胞内LC3过表达模型；运用反转录PCR方法检测α-synuclein和p62的mRNA水平；联合免疫荧光和共聚焦荧光显微镜观察细胞内自噬相关蛋白LC3和溶酶体标记物LAMP1共定位；以LysoTracker检测溶酶体酸性强度；使用LysoSensorYellow/Bluedextran探针定量测定溶酶体内的pH。结果：LPS作用后的小胶质细胞条件性培养基中IL-1β含量约为(320±67.8)pg/ml，TNF含量约为(1400±93.2)pg/ml，均显著高于对照组（P<0.01）。以anti-TNF抗体与条件性培养基共孵育后，

5、条件培养上清中TNF含量明显减少，而IL-1β含量无显著变化。将anti-TNF抗体结合或未结合的LPS刺激的条件性培养基或阴性对照组条件性培养基转移作用于PC12细胞，LPS刺激的条件性培养基组（anti-TNF未结合）α-synuclein水平明显高于正常PC12对照组和阴性对照条件培养基作用组，TNF去除组(与anti-TNF抗体结合)α-synuclein蛋III中文摘要肿瘤坏死因子通过自噬溶酶体途径影响α-突触核蛋白的清除白水平明显低于anti-TNF未结合组，。重组小鼠源性TNF-α(0、1、5、10、50、100和500ng/ml)作用于PC12细胞，细胞存活率呈TNF-α浓度依

6、赖性下降，α-synuclein的蛋白水平呈TNF-α浓度依赖性先上升后下降，而α-synuclein的mRNA水平无显著变化；用蛋白酶体抑制剂MG132抑制UPS通路时，α-synuclein的蛋白水平对比对照组并未发生明显的改变，用自噬阻断剂CQ抑制ALP通路时，α-synuclein的蛋白水平较对照组明显增加；LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平出现TNF-α浓度依赖性的同步增加，而p62的mRNA并未出现改变，过表达LC3后游离GFP蛋白水平随TNF-α的作用下降；在TNF-α的作用下，PC12细胞内的GFP-LC3(绿色荧光)和溶酶体标志物LAMP1（红色荧光）可以完全共定位，LysoTra

7、cker荧光强度下降，溶酶体内pH上升；mTORC1抑制剂PP242可以促进溶酶体酸化，转录因子EB（TFEB）和溶酶体表面标志蛋白（LAMP1）表达水平上调，溶酶体pH降低，部分逆转TNF引起的α-synuclein蛋白的蓄积增加。结论：TNF是激活的小胶质细胞生成和分泌的主要促炎症细胞因子之一；TNF导致PC12细胞内自噬溶酶体通路功能障碍、引起α-synuclein蛋白异常蓄积。PP242可