晚期糖基化终产物通过rageros通路影响肾小管上皮细胞自噬-溶酶体系统

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1、暨南大学博士学位论文题名（中英对照）：晚期糖基化终产物通过RAGE/ROS通路影响肾小管上皮细胞自噬-溶酶体系统Autophagy-lysosomesysteminrenaltubularepithelialcellsisdisruptedbyadvancedglyctionendproductsviaRAGE/ROSpathway作者姓名：皇甫长梅指导教师姓名及学位、职称：刘华锋博士教授学科、专业名称：内科学肾脏病论文提交日期：2015年10月19日论文答辩日期：2015年12月5日答辩委员会主席：徐军发教授论文评阅人：学位授予单位和日期：独创性

2、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库

3、进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：暨南大学博士学位论文摘要目的本研究探讨晚期糖基化终产物（AGEs）对肾小管上皮细胞（TECs）自噬-溶酶体系统的影响，及其是否通过与RAGE受体的相互作用引发氧化应激而造成溶酶体损伤，为糖尿病肾病的治疗提供新思路。方法AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞12h后，加用或不加用溶酶体抑制剂用蛋白免疫印迹和免疫荧光检测LC3

4、-II转化，研究AGEs对肾小管上皮细胞自噬活性的影响；运用免疫荧光共标记观察LAMP1和LC3-II共定位，检测AGEs对肾小管上皮细胞自噬泡与溶酶体融合的影响。AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞6、12、24h后,运用组织蛋白酶B（CB）、D、L试剂盒分别检测AGEs对HK-2细胞溶酶体组织蛋白酶的活性；免疫荧光和流式细胞术观察示踪红（TLR）荧光和DQ-卵清蛋白荧光，检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体酸化程度和溶酶体消化功能的影响；运用免疫荧光共标记观察LAMP1和CB荧光，检测AGEs对肾小管上皮细胞溶酶体完整性（溶酶体膜通

5、透化LMP）的影响。AGE-BSA(100μg/ml)刺激HK-2细胞，免疫荧光和流式细胞术观察阻断AGEs与抗体结合或抗氧化剂预处理对AGEs所致肾小管上皮细胞溶酶体酸化程度和溶酶体消化功能改变的影响，流式细胞术观察阻断AGEs与抗体结合或抗氧化剂预处理对AGEs所致肾小管上皮细胞ROS生成的影响。结果一、AGEs造成肾小管上皮细胞自噬通路受阻，自噬活性下降，AGE-BSA刺激12h后HK-2细胞LC3-II蛋白水平明显升高，但应用溶酶体抑制剂没有观察到LC3-II蛋白水平的额外增高。AGE-BSA刺激后HK-2细胞没有观察到LC3-II转化但L

6、C3-II光点可以和不规则的分布的LAMP1光点相融合。二、AGEs刺激导致HK-2细胞组织蛋白酶B（CB）、L活性明显降低，示踪红荧光和DQ-卵清蛋白的荧光明显减弱。免疫荧光双标记溶酶体膜蛋白LAMP-1及CB，AGE-BSA刺激后溶酶体膜蛋白LAMP1在细胞内分布不规则，聚集呈粗大成团状分布，CB的光点变得分散而不规则，和LAMP1没有明显的共定位，CB散布于LAMP1外。三、AGE-BSA刺激使HK-2细胞使示踪红荧光和DQ-卵清蛋白的荧光明显减弱。这种减弱可以被RAGE中和抗体或抗氧化剂预处理部分抑制；AGE-BSA刺激HK-2细胞ROS产

7、生明显增加。抗氧化剂NAC和catalase或抗RAGE中和抗体预处理均可以抑制AGE-BSA刺激HK-2细胞所导致的ROS产生。I暨南大学博士学位论文结论本研究发现，在糖尿病肾病状态下，AGEs通过RAGE/ROS通路介导了肾小管上皮细胞溶酶体损伤，导致自噬通路受阻，调控RAGE/ROS可以保护溶酶体，通畅自噬-溶酶体通路。关键词：晚期糖基化终产物，肾小管上皮细胞，溶酶体，自噬，氧化应激II暨南大学博士学位论文AbstractObjectiveIthasbeensuggestedthatautophagyprotectsrenaltubulare

8、pithelialcells(TECs)frominjuryindiabeticnephropathy.Thisstudy