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《转录组测序鉴定eb病毒相关胃癌差异表达基因及基因多态性的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、分类号：R373密级：不保密UDC：610学校代码：11065博士学位论文转录组测序鉴定EB病毒相关胃癌差异表达基因及基因多态性的研究刘术臻指导教师罗兵教授学科专业名称病原生物学论文提交日期2015年4月15日论文答辩日期2015年6月2日答辩委员会主席王志玉教授转录组测序鉴定EB病毒相关胃癌差异表达基因及基因多态性的研究中文摘要目的①筛选胃癌细胞系AGS稳定感染EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)后转录表达发生改变的特异基因，以及出现的特异基因结构变化，如单核苷酸多态性(Singlenucleo
2、tidepolymorphism,SNP)、可变剪切(alternativesplicing,AS)、插入/缺失(insertion/deletion,Indel)等，并对AGS细胞系中EBV病毒基因的表达进行分析。②选取转录组测序筛选出的由于EBV感染诱发的部分差异表达基因和单核苷酸多态性变异进行验证和比较分析，为筛选与EBVaGC发生、浸润、转移和预后等有关的分子标记物，阐明EBV致癌机制及寻找EBVaGC早期诊断、预后判断和治疗的新靶点提供实验基础和理论依据。方法①采用高通量转录组测序技术对AGS细胞系和稳定
3、感染EBV的AGS-EBV细胞系进行转录组测序，生物信息学技术对测序数据进行分析，包括测序数据的预处理、基因组比对、差异表达基因分析、差异基因mRNAGO(GeneOntology)富集分析、差异基因mRNAKEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)富集分析以及EBV表达基因分析。②提取AGS细胞系和AGS-EBV细胞系以及EBV阴性胃癌细胞系(SGC7901,MKN-45,HGC-27)和EBV阳性细胞系(GT38,GT39,SNU719)总RNA，采用实时荧光定量PCR(Q
4、uantitativereal-timePCR,qRT-PCR)对转录组测序筛选出的部分表达差异且与肿瘤关系密切的基因(REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1)的转录表达进行验证。并采用免疫组化技术检测EBVaGC和EBVnGC组织中REG4基因的表达。③选择山东地区胃癌组织标本，提取新鲜胃癌组织和石蜡包埋胃癌组织DNA，PCR结合DNA测序或限制性片段长度多态性技术(restrictivefragmentlengthpolymorphisms,RFLP)检测EBVaGC和EBVnGC组织
5、中EDAR,WDR62,GPC4,FLG,CTH,CPOX,SPG11,CASC5及ZFYVE27基因编码区特定位点SNP(rs3827760,rs1008328,rs1048369,rs2065955,rs1021737,rs1131857,rs3759871,rs7177192以及rs1088299的分布。其中FLG，CPOX和CTH基因扩增产物分别选择限制性核酸内切酶ApalI、HaeIII、ApoI酶切进行限制性片段长度多态性分析，其余6种基因的PCR产物均送上海迈浦基因有限公司采用末端终止法进行双向测序，
6、Chromas软件查看测序峰图文件，DNAStar软件(Larsergene，version7.0)进行序列剪接和对比分析，并与相应基因序列及基因文库库中的标准序列进行对比分析。结果①与AGS细胞系比较，稳定感染EBV后，AGS-EBV细胞系共有3880条基因mRNA出现表达差异，其中1651条基因表达上调，2229条基因表达下调。②差异转录表达mRNAGO富集分析结果表明，有较多基因参与蛋白结合、细胞质、膜整合、细胞膜、细胞核和金属离子结合等GOterm；共有946差异基因涉及与肿瘤相关的信号转导、细胞凋亡、细胞
7、增生、细胞黏附、肿瘤抑制以及免疫相关等功能，其中上调基因360条，下调基因586条。③差异表达基因的KEGG分析结果显示，较多差异表达基因参与代谢途径、肿瘤途径、细胞内吞以及灶性粘附等途径。④AGS细胞稳定感染EBV后，细胞基因出现特征性的结构改变，包括SNP、AS和INDEL等，某些改变可能与差异表达基因相关。⑤EBV稳定感染的AGS细胞中，共检测到65种EBV基因表达，以表达量计算前10位表达的EBV基因分别为BXLF2,BXLF1,LF3,BVRF1,BMRF2,BHLF1,LMP2,BILF1,BILF2以
8、及BVLF1。⑥EBV阳性和阴性胃癌细胞系中，REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1基因表达差异倍数和表达趋势与AGS和AGS-EBV两种细胞系转录组测序结果一致。⑦免疫组化检测结果显示，48例EBVnGC组织中有4例癌细胞中观察到REG4阳性信号，而42例EBVaGC组织均为阴性；统计学分析表明，2种胃癌组织中REG4表达无显著性
