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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文假盘菌诱导下紫花苜蓿不同株系的转录组测序与抗病相关基因差异表达研究Transcriptomecharacterizationanddifferentialexpressionanalysisofresistance-relatedgenesbasedonRNASequencingindifferentalfalfalinesinfectedbyPseudopezizamedicaginis黄海燕指导教师姓名王生荣教授（甘肃农业大学兰州730070）袁庆华研究员（中国农科院北京畜牧兽医研
2、究所北京100193）学科专业名称植物病理学研究方向植物病原真菌与病害论文答辩日期2015年5月30日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席李春杰教授评阅人徐秉良教授李敏权研究员2015年6月甘肃农业大学2015届硕士学位论文摘要苜蓿（MedicagosativaL.)褐斑病由苜蓿假盘菌（Pseudopezizamedicaginis（Lib.）Sacc.）引起，是苜蓿最常见和破坏性较大的病害之一，影响苜蓿光合物质的积累，使其产量受到极大损失。了解紫花苜蓿在苜蓿假盘菌诱导下抗病相关酶活性和转录组的变化，可以挖掘与苜蓿褐斑病抗性相关的重要基因
3、及生物学通路，对揭示苜蓿抗褐斑病生理生化机制和分子调控机制具有重要意义。本试验以苜蓿高抗褐斑病株系DR1111和高感褐斑病株系DS10为材料，通过测定多胺氧化酶(polyamineoxidase，PAO)、二胺氧化酶(diamineoxidase，DAO)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)的活性以及运用高通量转录组测序，拟从生理水平和分子水平两个层面上阐述苜蓿抗褐斑病生理机理以及相关基因的响应机制。研究结果如下：1.苜蓿高抗褐斑病株系DR1111和高感株系DS10在苜蓿假
4、盘菌（Pseudopezizamedicaginis）诱导下0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d、15d、20d后叶片中4种酶活性均有提高，接菌后的20d内酶的活性变化基本上呈现出先升高再降低的趋势，高抗株系的DAO活性显著高于高感株系（P<0.05)；而感病株系的SOD活性在第3d～10d要显著高于抗病株系(P<0.05）。高抗株系DR1111的PAO和DAO活性峰值的出现早于高感株系DS10，而CAT活性峰值则晚于高感株系DS10。2.利用高通量转录组测序技术并通过无参考基因的denovo组装，从苜蓿假盘菌诱导后的苜蓿叶片cDNA样
5、本中总共得到83,625条转录本包括35,061个基因，总碱基数为100,107,179bps。每个转录本的平均长度为1,197.1bps，最短序列长度为351bps，最长的为15,420bps。3.经过对所有转录本（83,625）序列ORF的预测后，有54,261个具ORF的转录本与NT、NR、String、COG、GO和KEGG六个数据库比对，数目分别为54,620、54,620、27,490、14,567、34,693和14,374个；没有ORF的转录本经比对后注释到以上数据库数目为15,902、9,069、1,381、520、4,70
6、7和1,663个。通过与COG数据库的比对，将其分为25个不同功能注释，其中涉及一般功能预测、复制、重组及修复、转录和信号传导等功能转录本分布较多。4.将苜蓿抗、感褐斑病转录本中组装得到的高质量序列经过RSEM和edgeRI甘肃农业大学2015届硕士学位论文两个软件的估计、识别，以FDR<0.05和∣log2FC≧2∣进行对显著差异基因的筛选，苜蓿高抗褐斑病（RIvsRCK）转录组35,061个转录本中，331个上调基因和80个下调转录本，在高感褐斑病（SIvsSCK）转录组35,061个转录本中，436个转录本上调，327个转录本下调。5.
7、对全部的差异表达的转录本进行GO功能和KEGG通路显著性富集分析，苜蓿高抗褐斑病(RIvsRCK）转录组中表达上调的转录本被显著富集到105个terms，表达下调的转录本被显著富集到33个terms，在高感褐斑病（SIvsSCK）转录组中显著差异表达上调转录本被富集到67个terms，显著差异表达下调的转录本被富集到75个terms，我们发现紫花苜蓿高抗褐斑病（RIvsRCK）转录组和高感褐斑病（SIvsSCK）转录组中与抗病相关的显著差异表达的转录本主要被富集在植物与病原物的相互作用、蛋白质在内质网上的加工、植物激素信号转导，苯丙氨酸代谢，
8、异喹啉类生物碱的生物合成，酪氨酸代谢等通路。6.挑选出8个基因（POD、TIFY10、STK、DRP、ERTF、TIR-NBS-LRR、WRKY、PR1a）通过相对
