高粱sbgaba-ts基因的克隆、功能研究及其遗传转化体系的建立

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1、高粱SbGABA-Ts基因的克隆、功能研究及其遗传转化体系的建立2012级杨泽伟硕士生物化学与分子生物学朱莉副研究员ClassifiedIndex:U.D.C:SouthwestUniversityofScienceandTechnologyMasterDegreeThesisIsolation,CharacterizationandGeneticTransformationoftheSbGABA-TsgenesinSorghum[Sorghumbicolor,(L.)Moench]Grade:2012Candidate:YangZeweiAcademicDegreeAppliedfor:M

2、asterSpeciality:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:prof.ZhuliApr.1,2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于论文使用和授权的说明本人完全了解西南科技大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文的复印件，允许该论

3、文被查阅和借阅；学校可以公布该论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。（保密的学位论文在解密后应遵守此规定）西南科技大学硕士研究生学位论文第I页摘要生态环境恶化严重影响作物生长发育及产量。作为粮饲能兼用的世界第五大农作物，高粱具有生长迅速、产量高、抗逆性突出等诸多优点，其种质的创新与性状改良对于解决耕地、人口、资源、能源与环境之间矛盾有重要意义。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）途径代谢旁路途径位于TCA循环的一个支路，已有研究表明，该途径与呼吸作用、激素合成、多胺代谢、活性氧生成、信号传递等生理过程联系紧密，参与植株的生长发育和胁迫应答调

4、控。高粱中GABA途径的研究尚属空白。本研究首次从高粱中分离了与GABA代谢相关的关键基因γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）基因，并对其进行了亚细胞定位分析、原核表达和酶活分析、组织发育和胁迫应答表达模式分析，同时对农杆菌介导的高粱幼胚遗传转化体系进行了研究，主要结果如下：1.利用同源序列比对和RT-PCR技术首次从高粱中分离鉴定出SbGABA-Ts基因，该基因存在两个亚型（登录号分别为：XM_002445162、XM_002-447046），其氨基酸序列相似性为78.8%；保守结构域分析表明，这两个基因均隶属于乙酰鸟氨酸转氨酶（AAT_Ⅰ）超家族；系统发育树分析显示SbGABA-Ts归属于

5、单子叶植物分支，与水稻GABA-T基因亲缘关系较近。2.通过SbGABA-Ts的N端信号肽序列与GFP融合表达，利用烟草叶片瞬时表达系统进行亚细胞定位分析，激光共聚焦显微镜（CLSM）观察可知，SbGABA-Ts均定位于线粒体中，表明SbGABA-Ts主要在线粒体中行使功能。这与SbGABA-Ts亚细胞定位的在线程序预测结果一致。3.去除信号肽的SbGABA-Ts基因的编码区序列，能通过大肠杆菌原核表达系统高效表达，重组蛋白经过纯化和蛋白酶活性测定，结果表明SbGABA-Ts蛋白具有γ-氨基丁酸转氨酶活性，并能以丙酮酸和乙醛酸为氨基酸受体，而未检测出α-酮戊二酸代谢活性。4.通过实时荧光定量

6、PCR检测高粱SbGABA-Ts基因的组织发育表达模式，结果表明，SbGABA-Ts在高粱各组织器官的不同发育阶段均有表达，丰度随组织发育有所变化；持续高盐胁迫下高粱幼苗SbGABA-Ts基因的表达模式表明，SbGABA-Ts的表达受盐胁迫诱导，其丰度的增加一定程度上与积累的GABA含量相适应，表明SbGABA-Ts可能通过促进GABA的分解代谢参与植物的逆境胁迫响应。胁迫下高粱叶片中SbGABA-Ts的表达具有明显的昼夜节律性。西南科技大学硕士研究生学位论文第II页5.利用高粱幼胚为受体材料，探究高粱基因型对组培过程的影响，结果表明，基因型在愈伤组织诱导、增殖和分化过程中均扮演了关键角色，

7、绝大多数品种容易发生褐化导致愈伤组织异常生长，而褐化较轻的品种往往在组培过程中表现良好。通过优化高粱遗传转化体系，利用农杆菌介导法，最终成功获得了SbGABA-Ts基因的过表达植株，为进一步验证其功能创造了材料。这些研究结果为深入了解GABA途径调控植物生长发育和胁迫应答的分子机理奠定了基础，为研究高粱抗逆分子机理和抗逆基因工程提供了科学依据，为利用基因工程的方法改良作物的抗逆性创造了条件。关键词：GABA-