鸭疫里默氏杆菌phop基因鉴定及其突变株的免疫效果评价

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1、８５８２分巧号Ｓ．３学号Ｓ２０口３引９四川巧化大学顽壬学位论文鸭疫里默巧巧菌廢因鉴定及其突变株的免疫效果评价张洁指导素巧孔庆科教巧学科专业巧巧＃医学研巧方向动物巧生衔与免巧学２０１炸６月论文独削性寅明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的。成果尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机一．构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并

2、表示了谢意。研究生签名；年月日聲珠６关于论文使用授巧的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即；学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复巧件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可ｔｕ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＿＿＂＂（请在上□内划ｖ）研究生签名：＞０年＾月曰珠巧／若导师签名ＸｒｔｊＴ年＾月＂日中文摘要鸭疫里默氏巧菌（乂ｋｗｅｒｅ航ｆｔｆｕａ邮ｅ邱向％Ｒ

3、Ａ）是影响我国养鸭业最为严重的疾一病病原之，该病在养殖地区分布广泛，感染主要引起也包炎、肝周炎和气囊炎等，造成维鸭生长缓慢、大批死亡严重制约着我国养鸭业发展。ＲＡ有２１种血清型且不同血清型间交叉保护效果不好一，目前市售疫苗存在些缺陷如应用比较广泛的油郭剂灭活苗无法提供完全保护（７０％左右的保护率）且存在注射吸收不理想，毒株覆盖不完全等问题。一－ＣＨ我们利用基因工程技术制备ＲＡ１基因缺失活疫苗，旨在寻找种能有效对ＲＡ进行有效减毒的疫苗株用于对该疾病的预防。本研究首先通过序列对比设计引物－ＣＨ１潜在的基因基克隆了ＲＡ。然后为了验证克隆基因的正确性

4、，我们将扩增因片段连接到低拷贝的ＰＹＡ３３３７质粒上，再将重组质粒导入沙口氏菌ＡｐＡｏ户基因缺－失株中进行功能鉴定。结果表明，ＲＡＣＨ１潜在的ｐＡｏｆ基因能够回补沙口菌ｐＡｏｆ基因的功能。同时，生物信息学预测结果显示克隆的切户基因编码的ＰｈｏＰ蛋白没－有信号肤位点和跨膜区。接着ＲＡＣＨｌＡｏｆ，我们对ｆ基因进行了原核表达及多克隆抗体制备，ＰＣＲ扩增如ｏｆ基因连接至表达载体ｐＥＴ３２ａ后转入獻ｓｗａ表达菌中。按照蛋白表达流程对其进行表达并优化表达条件，将表达蛋白进行纯化后免疫兔子制备多克隆抗体，琼扩试验测定多次免疫后兔子免疫抗血清效价比达到１：１６，这为后续研

5、究细菌中如Ｗ户调巧网络及与蛋白间相互作用奠定了基础。ＲＥ－我们还通过Ｐ１１２自杀质粒介导的同源重组构建ＲＡＣＨｌＡｐＡｏｆ基因缺失株，并对其生物学特性、免疫原性和免疫保护效应进行了系统性的研究。根据ＲＡｐＡｏｆ上下游序列设计引物，通过交叠ＰＣ民顧合基因同源臂并在插入Ｓｐｅｃ抗性基因，ＲＥ－－－－构建重组质粒ｐｌ１２ＬｅｆｔＳｐｅｃＲｉｇｈｔ，通过细苗结合法将重组质粒导入ＲＡＣＨ１中，＞－ＣＨ－用卡那霉素和壮观霉素双抗筛选得到ＲＡｌＡｐ／ｗ／基因缺失株，对ＲＡＣｍＡ如０戶进行生物学特性研究：生长曲线测定表明该突变株生长略慢于野生株；药敏试验表明缺失

6、株对氨节西林敏感性下降，对庆大霉素敏感性上升：测定缺失株对鸭胚成纤维粘附力与侵袭力能力发现与亲本株无明显差异；检测組织载量发现突变株接种后１２ｈ肝脏和２他大脑中组织载量显著低于野生株，；另外毒力试验发现基因缺失株毒力减－ＣＨｌＡｐ＆ｏ户近１００倍。最后，我们巧估了ＲＡ基因缺失株的免疫原性及免疫保护效果，将疫苗株经腿部肌肉注射接种维鸭ＸＬＤ一，Ｈ周后用约１５Ｏ５０剂量同源株攻毒并记录Ｉ一个月内维鸭的生长情况。通过ＥＬＩＳＡ检测了体液免疫反应，结果表明，免后１４、２１天周免疫纽的血清ＩｇＧ抗体滴度水平明显高于对照组，表明该缺失株激发动物机１００％体产生

7、了高水平的体液免疫反应，且免疫，攻毒后缺失株免疫组动物存活率为ＲＡ－ＣＨ。ｌＡＡｏ戶毒力减弱组鸭子体重増长未受到显著影响Ｗ上结果表明ｆ，具有较好一的免疫原性并能产生定的免疫保护效应。关键词：鸭疫里默氏巧菌；ｐＡｏＰ；突变株；毒力；免疫保护效应ＩＩＩｄｅｎｔｉｆｉｃａ杜ｏｎｏｆｇｅｎｅａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｍｕｔａｎｔｖａｃｃｉｎｅｉｎＲｉｅｍｅｒｅｌｌａａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒＡＢＳＴＲＡＣＴＲｉｅｍ