avbd2在毕赤酵母中的组成型表达及其发酵条件优化

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1、１３６４０９３５单化代码：Ｑ；分类号？１２７２０４１１：密级弓＿；学在教在＊乂ｆ学位论文ＡｖＢＤ２在毕赤酵母中的组成型表达及其发醇条件化化Ｃｏｎｓｔｋｕｔｉｖｅｅｘｒｅｓｓｉｏ凸ｏｆＡｖＢＤ２化巧从沁必献佑沁ａｎｄｐｏｔｉｍｉｚａ村ｏｎｏｆｉｔｓ：ｆｅｎｎｅｎｔ：ａ村ｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｐ研究生：魏海婷指导教师：祁巧宗教授申请学位口类级别；巧学硕±专业名称：微生物学与生物制药研究方向：微生物所在学院；牛命科举举院：答辩委员会主席二零一五年五月项

2、目资助国家“863”计划编号2006AA10Z320安徽省教育厅科研重点项目编号：KJ2011A122I摘要鸡β-防御素2(Chickenbeta-defensins2，AvBD2)是一个富含半胱氨酸阳离子的小分子多肽，其成熟肽由39个氨基酸残基组成，在鸡的消化道组织中广泛表达，且抗菌谱广、抗菌活性较强，对鸡的先天性免疫和获得性免疫起着重要的作用。因此，AvBD2有望成为传统抗生素的替代品而应用于畜禽养殖业。本实验以AvBD2为研究对象，利用甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成型表达载体pGHKα，构建了鸡AvBD2的毕赤酵母组成型表达系统，并研究其表达产物活性；同时，采用响应面法优化摇瓶

3、发酵的接种量、装液量和发酵温度，为AvBD2的发酵生产及其产业化应用提供理论依据，主要研究内容如下：1、AvBD2在毕赤酵母中的重组与组成型表达依据NCBI中报道的AvBD2cDNA编码区序列(登录号：NM_204992），参考毕赤酵母的密码子偏爱性，合成pUC57-AvBD2克隆载体。使用EcoRⅠ与NotⅠ双酶切pUC57-AvBD2和载体pGHKα，回收目的片段并连接，构建重组质粒pGHKα-AvBD2。经SacⅠ和BglⅡ依次酶切pGHKα-AvBD2，使其线性化，去除其中Amp抗性基因。将线性化片段转化至毕赤酵母GS115，根据其G418抗性及蛋白表达量，挑选出高表达菌

4、株。表达上清经Tricine-SDS-PAGE和WesternBlot分析显示，重组菌能够分泌5.8kDa的AvBD2蛋白。2、重组AvBD2的活性分析将高表达菌株接种于发酵培养基中，过夜培养，浓缩发酵液上清进行抑菌和溶血活性分析。琼脂扩散法抑菌实验表明，表达的重组AvBD2蛋白对大肠杆菌、绿脓假单胞菌、产气肠杆菌、粪肠球菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用；浓度为100、250和500mg/L的重组AvBD2总蛋白对2%−3%鸡红细胞的溶血率分别为0.74%、1.12%和2.17%。3、重组AvBD2发酵条件的优化将得到的高表达菌株于YPD培养基培养，测定其生长曲线，

5、结果表明培养20h的重组菌，活力最强。首先对重组毕赤酵母发酵温度、接种量、装液量三个因素进行独立优化，分别得到最优的单因素水平；继而通过响应面法优化，得出在14.44%的接种量、8.43%的装液量、27.8℃的发酵温度条件下，重组菌的表达量最大，较优化前提高20%。本研究以组成型表达载体pGHKα为基础，构建重组AvBD2毕赤酵母工程菌；Tricine-SDS-PAGE和Westernblot结果表明，重组酵母成功表达出目的蛋白；抗菌活性和溶血活性结果表明，重组酵母发酵产物的上清液对多种病原菌有抑制作用，并且在500mg/L浓度下的溶血活性仅为2.17%；通过响应面法优化发酵条I

6、件，得到重组酵母最佳表达条件为：接种量14.44%、装液量8.43%、发酵温度27.8℃，蛋白质浓度较优化前提高20%。本研究为AvBD2的生物合成、发酵生产及产业化应用提供了基础。关键词：β-防御素，毕赤酵母，组成型表达，活性分析，发酵优化IIAbstractAvainbeta-defensin2maturepeptide(AvBD2),asmallcysteine-richcationicpeptide,iscomposedof39aminoacidsandplaysanimportantroleintheinnateimmunityandacquiredimmunityof

7、chicken.Itiswidelyexpressedinthedigestivetract,andhasastrongantimicrobialactivity.Moreover,ithasabroadspectrumofantimicrobialactivitywithoutresiduesandbacteriaresistance.AvBD2hadbeenexpectedtobecomeasubstituteofthetraditionalantibioticswhichc