microrna-494调节tnf-α诱导髓核细胞凋亡的实验研究

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1、分类号：R681学校代码：10062密级：学号：2012602822硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：MicroRNA-494调节TNF-诱导髓核细胞TITLE凋亡的实验研究TheroleofmicroRNA-494inTNF--inducednucleuspulposuscellapoptosis一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外论文作者：李鹏飞指导教师：马信龙天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类号：R681学校代码：10062密级：学号：2012602822学位类别：科学学位专业学位☑学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION

2、论文题目：MicroRNA-494调节TNF-诱导髓核细胞凋亡的实验研究TITLETheroleofmicroRNA-494inTNF--inducednucleuspulposuscellapoptosis一级学科：临床医学二级学科：外科学骨外论文作者：李鹏飞指导教师：马信龙导师组成员：张晓林李建江王涛天津医科大学研究生院二〇一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了

3、明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：椎间盘退行性改变的分子生物学机制仍不明确，髓核细胞凋亡增加在椎间盘退变发生发展过程中发挥重要作用。TNF-可以诱导髓核细胞凋亡，与椎间盘退

4、变密切相关，外源性因素作用于细胞表达受体，内源性因素可能发挥调节作用，其中就包括microRNAs（miRNAs）。课题组前期研究发现椎间盘退变患者的髓核组织中存在异常表达的miRNAs，其中microRNA-494(miR-494)异常高表达，然而，miR-494在TNF-诱导髓核细胞凋亡中的潜在作用机制仍然不明确。使用TNF-刺激髓核细胞，建立髓核细胞凋亡模型；运用慢病毒包装miR-494转染髓核细胞，探究miR-494对TNF-诱导髓核细胞凋亡的影响并探究其潜在作用机制，为椎间盘退变发病机制的研究奠定一定基础，开拓椎间盘退变基因诊断和生物治疗新视野。方法：收集脊柱爆裂骨折患者病例资

5、料及术中摘除的髓核组织，根据患者术前影像学资料（X线，CT,MRI）进行TLISS评分系统和载荷分享评分系统评分，根据MRI进行Pfirrmann分级评价椎间盘退变程度。运用酶消化法进行髓核细胞原代培养，并鉴定获取的髓核细胞。分别使用不同浓度TNF-(0ng/ml,10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml)刺激髓核细胞，在0h,8h,16h,24h时间点，使用流式细胞术（AnnexinV-PE/7-AAD）和实时荧光定量PCR检测髓核细胞凋亡率及miR-494表达量。然后，将慢病毒包装的antigomiR-494感染髓核细胞，成功敲除髓核细胞内源性miR-494，转染后再加入TNF-

6、(100ng/ml,16h)，流式细胞术检测细胞凋亡率和荧光定量PCR检测miR-494表达量。运用生物信息学方法、荧光素酶双报告基因分析技术及免疫蛋白印迹技术（Western-blotting）验证JunD是否是miR-494的靶基因之一。最后，Western-blotting检测细胞色素C表达水平。结果：髓核细胞凋亡率随TNF-浓度和刺激时间的增加而增加（P<0.05），miR-494表达量亦是随TNF-浓度和刺激时间的增加而增加（P<0.05），然而100ng/ml,16h组，髓核细胞凋亡率最合适，用于后续实验。细胞转染后，antigomiR-494+TNF-组与对照病毒+TNF

7、-组相比，细胞凋亡率和miR-494表达量明显下降（P<0.05）。生物信息学方法预测、荧光素酶双报告基因验证证实miR-494直接靶向JunD基I因。Western-blot结果显示antigomiR-494+TNF-组JunD蛋白表达水平较对照病毒+TNF-组高，且有统计学意义（P<0.05），进一步说明miR-494对JunD基因的靶向作用，antigomiR-494+TNF-组细胞