黑曲霉ras基因功能的初步探究.pdf

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1、硕士学位论文黑曲霉ras基因功能的初步探究PRELIMINARYSTUDYONFUNCTIONOFrasGENEFROMAspergillusniger宋佳哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q933学校代码：10213国际图书分类号：579密级：公开理学硕士学位论文黑曲霉ras基因功能的初步探究硕士研究生：宋佳导师：宋金柱教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学ClassifiedIndex:Q933U.D.C:579DissertationfortheMasterDegreeinSciencePRELIM

2、INARYSTUDYONFUNCTIONOFrasGENEFROMAspergillusnigerCandidate：SongJiaSupervisor：Prof.SongJinzhuAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要黑曲霉（Asp

3、ergillusniger），因其代谢产物较多，并且拥有丰富的酶系而成为曲霉属中工业生产应用最为广泛的一个常见种。而后基因组时代的来临，也将黑曲霉的研究推入基因工程的领域。作为小G蛋白的重要成员，多功能细胞因子Ras的研究热度一直有增无减，不过在真菌中关于Ras的报道仍是少数，而黑曲霉中ras基因的功能更是一直不明确。因此，利用分子生物学的手段对ras基因在黑曲霉中的功能进行探究，一方面为菌种改造奠定基础，另一方面也将对小G蛋白在真菌中的深入研究具有推进作用。本文采用基因过表达的方法使ras基因表达量提高，通过对转化子及野生型菌株的生物学特性的差异进行分析，初步探究ras基因在黑曲霉CGM

4、CC3.316中生长及代谢过程中的作用。首先，根据实验室已知的ras基因部分保守序列及NCBI中同源性较高的两组序列预测ras基因的编码区序列，多次设计引物后成功克隆得到目的基因。然后，将目的基因两侧加上合适的酶切位点，与pCAMBIA1301质粒和pBARGPE1-Hygro-EGFP质粒进行酶切、连接、转化，完成两种类型过表达质粒的构建。接下来，选定PEG介导的原生质体转化法进行质粒的转化，筛选具有潮霉素B抗性转化子，再选取其中部分抗性转化子进行目的基因遗传稳定性检测，共获得既具有潮霉素B抗性又具有遗传稳定转化子8株，即作为空白对照的pCAMBIA1301空质粒转化子，pBARGPE1

5、空质粒转化子，及过表达转化子pCAMBIA1301:ras（pC:ras），pBARGPE1:ras（pB:ras）各2株。最后，对转化子及野生型进行了生物学差异的试验。（1）RT-PCR结果显示，pC:ras，pB:ras两株转化子ras基因表达量分别上升4.49倍和7.82倍。Westernblot结果显示，Ras蛋白表达量也均有所上升。（2）通过测量培养5天的菌落直径发现pC:ras，pB:ras两株转化子生长速度分别是野生型菌株的1.10倍和1.17倍，测量培养60h的生物量结果为1.53倍和1.98倍。（3）液体发酵试验，测定pC:ras，pB:ras两株转化子纤维素总酶活最高时

6、是野生型的1.30倍和1.44倍，柠檬酸酸度分别是1.40倍和1.86倍。并且实验过程中pB:ras过表达转化子在转化效率和过表达效果上均有优于pC:ras过表达转化子的趋势。本研究结果初步说明，黑曲霉ras基因的过表达对黑曲霉生长状态及代谢过程是有促进作用的。关键词：黑曲霉CGMCC3.316；ras基因；基因过表达；生物学特性-I-哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractAspergillusnigerisacommonspeciesintheindustrialproductionofAspergillus,whichiswidelyusedbecauseofitslargea

7、mountofmetabolitesandrichenzymesystem.Theadventofthepost-genomeerahasalsopushedtheresearchofAspergillusnigerintothefieldofgeneticengineering.AsanimportantmemberofthesmallGprotein,theresearchofthemulti-functionalc