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单位代码10635学号112013316001140硕士学位论文纳米材料增强电致化学发光手性氨基酸传感器研究论文作者：王庆红指导教师：傅英姿教授学科专业：分析化学研究方向：纳米材料及电化学生物传感器提交论文日期：2016年4月18日论文答辩日期：2016年5月30日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年4月 独创性声明学位论文题目：纳米材料增强电致化学发光手性氨基酸传感器研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日2 目录摘要......................................................................................................................................IAbstract..................................................................................................................................III第1章绪论.........................................................................................................................11.1手性及手性识别研究意义.........................................................................................11.2手性识别方法..............................................................................................................31.3重要的发光体系..........................................................................................................71.4贵金属纳米材料在电致化学发光传感器中的应用...............................................91.5功能化碳纳米材料电致化学发光传感器中的应用.............................................101.6本文研究思路............................................................................................................11第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究..................................................132.1引言.............................................................................................................................132.2实验部分....................................................................................................................142.3结果与讨论................................................................................................................152.4结论.............................................................................................................................21第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究...............................................................................................................................233.1引言.............................................................................................................................233.2实验部分....................................................................................................................243.3结果与讨论................................................................................................................263.4结论.............................................................................................................................33第4章基于金钯纳米合金、功能化石墨烯的电致化学发光L-谷氨酸传感器研究................................................................................................................................................354.1前言.............................................................................................................................354.2实验部分....................................................................................................................364.3结果与讨论.................................................................................................................374.4结论.............................................................................................................................43参考文献...............................................................................................................................45硕士期间科研成果...............................................................................................................63 致谢....................................................................................................................................65 摘要纳米材料增强电致化学发光手性氨基酸传感器研究分析化学专业硕士研究生王庆红指导教师傅英姿教授摘要手性是自然界的基本属性之一，手性识别研究在生命科学、食品科学、医药科学及材料科学领域具有重要的研究价值。发展响应灵敏、操作简单、成本低廉、检测快速的手性识别方法成为生物及药物的研究热点。电致化学发光技术是近年来发展起来的一种新型检测技术，它为手性识别研究提供了新思路、新想法。纳米材料中，金属纳米材料和碳纳米材料具有优良的电化学性能、较大的比表面积、较好的生物相容性等优点，可广泛应用于生物分子等手性选择剂的固载，为手性电致化学发光传感器的制备奠定了良好的基础。本文主要通过制备贵金属纳米材料和功能化碳纳米材料，并将其应用于手性传感界面的构建，以实现对氨基酸对映体简单有效、快速灵敏的识别和定量检测。主要内容有以下三部分：1.研究了新型兼具电致化学发光性质和立体选择性的纳米复合杂化材料与脯氨酸对映异构体（Pro）的相互作用。该研究体系中，在玻碳电极表面采用具有良好成膜性的阳离子交换剂Nafion固载由联吡啶钌-金纳米粒子复合材料和β-环糊精-石墨烯纳米复合材料混合制备的纳米复合杂化材料，用扫描隧道电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和拉曼（Raman）光谱技术对纳米材料特性进行研究，采用电致化学发光技术（ECL）考察了该纳米复合杂化材料与脯氨酸对映异构体的相互作用。实验结果表明，该纳米复合杂化材料修饰电极能与Pro发生相互作用，并且对D-Pro产生更强信号响应，能够对脯氨酸对映异构体产生手性识别。2.研究了由D-氨基酸氧化酶、金铂纳米合金材料和多壁碳纳米管构建的手性生物传感界面与D-丙氨酸的相互作用。SEM、循环伏安技术（CV）和电化学交流阻抗技术（EIS）用于电极修饰过程表面形貌和电化学性能测试，能量散射光谱仪I 西南大学硕士学位论文（EDS）用于电沉积金铂纳米合金材料的制备监控。该体系以鲁米诺为发光探针检测电致化学发光信号，因D-氨基酸氧化酶在对D-氨基酸特异性催化氧化过程中产生的过氧化氢是鲁米诺电致化学发光的共反应试剂，可以极大地增强鲁米诺的发光强度。实验结果表明，该传感器能够对一系列的D-氨基酸产生信号响应，并且对D-丙氨酸（D-Ala）的响应更好，而对L-丙氨酸（L-Ala）响应很差，因此能够实现对D-Ala的特异性识别与定量检测。3.研究了基于L-谷氨酸氧化酶/金钯纳米合金/氯化血红素-还原氧化石墨烯构建的生物传感界面与L-谷氨酸或D-谷氨酸（L-或D-Glu）的相互作用。修饰电极的构建过程如下，首先将化学还原法制备的氯化血红素-还原氧化石墨烯复合材料滴涂在玻碳电极表面，然后采用恒电位法制备金钯纳米合金材料，最后利用Au-S、Au-N键和静电吸附作用结合L-谷氨酸氧化酶，从而构建了酶生物传感界面。扫描SEM、EDS、紫外-可见（UV-Vis）、CV和EIS对电极修饰材料和电极修饰过程进行研究。由于L-谷氨酸氧化酶能特异性催化L-Glu的过程中产生过氧化氢，以鲁米诺为发光探针。实验结果表明，该生物传感器能够对L-Glu产生良好的信号响应，而无法对D-Glu和其它氨基酸产生信号响应，因此该传感器能够实现对L-Glu的有效识别与高灵敏检测。关键词：手性识别；电致化学发光；氨基酸；贵金属纳米材料；功能化碳纳米复合材料II AbstractStudiesonelectrochemiluminescencesensorsenhancedbynanomaterialsforchiralrecognitionofaminoacidenantiomersMajor:Anal.Chem.,Postgraduate:QinghongWangSupervisor:ProfessorYingziFuAbstractChiralityisoneofthefundamentalpropertiesofnature,andreasearchesaboutithaveimportantapplicationvalueinthefieldsoflifescience,foodscience,medicalscienceandmaterialsscience.Therefore,itisofgreatsignificancetodevelopanalyticalmethodsforchiralrecognitionwhichareresponsive,simple,lowcost,fast.Electrochemiluminescencetechniqueisanewandpowerfultool,whichcanactaseffectivelyanalyticalapproachforchiralrecognition.Metallicnanomaterialsandfunctionalcarbonnanomaterialspossessamultitudeofadvantanges,whichcanbewidelyappliedinchiralrecognitonviaelectrochemiluminescence.Thecombinationofthenanomaterialswithbiomoleculesandotherchiralselectorscanbewellachievedbyusingexcellentelectrochemicalperformance,largespecificsurfaceareaandgoodbiocompatibility,whichisthekeystepforconstructingthechiralsensingplatformstoenantioselectivelydistinguishaminoacidenantiomers.Themainresrearchoftheworkincludesthreefractionsasfollows:1.Asensitive,stableandstereoselectiveelectrochemiluminescence(ECL)sensorhasbeendesignedtoenantioselectivelydiscriminateprolineenantiomersbyimmobilizingRu(bpy)32+-goldnanoparticles(Ru-AuNPs)andβ-cyclodextrin-reducedgrapheneoxide(β-CD-rGO)onglassycarbonelectrode.MoreRu(bpy)2+3couldbeimmobilizedonthesurfaceofelectrodestablyviapreparingRu-AuNPsandbetterstereoselectivitycouldbeintroducedtothesensorviathesynthesisofβ-CD-rGO.WhenthedevelopedsensorinteractedIII 西南大学硕士学位论文withprolineenantiomers,obviousdifferenceofECLintensitiestowardsL-andD-prolinewasobserved,andalargerintensitywasobtainedfromD-proline.Asaresult,ECLtechniquemightactasapromisingmethodtochiralrecognizeofaminoacidsenantiomersorchiraldrugs.2.AnewbiosensorspecifiedforD-aminoacids(DAAs)basedontheelectrochemiluminescence(ECL)ofluminolwasproposedbycouplingD-aminoacidoxidase(DAAO)toinsitugeneratecoreactantwithfunctionalizedMulti-walledcarbonnanotubes(F-MWCNTs)andAu-PtalloynanoparticlesascatalystsfortheECLreaction.Thestepwisefabricationprocessofthebiosensorwascharacterizedviacyclicvoltammetry(CV),electrochemicalimpedancespectroscopy(EIS)andscanningelectronmicroscopy(SEM).Furthermore,theAu–PtnanostructureswithdifferentmolarratiosbetweenAuandPtprecursorswereinvestigatedbyscanningelectronmicroscopy(SEM),energy-dispersivespectroscopy(EDS)andECLtechnique,andtheoptimumAu/PtratioforECLmeasurementswas1:1withanoptimizedelectrodepositiontimeat400s.TheproposedbiosensorshowedexcellentperformanceinthestereoselectiverecognitionofD-alaninewithalowdetectionlimitof1.67×10−9M.Hence,thispaperwouldprovideanewplatformonthespecificdetectionofD-alaninewithhighsensitivity,goodselectivityandacceptablestability.3.Anovelelectrochemiluminescencebiosensorbasedonhemin-reducedgrapheneoxide(H-RGO)andAu-Pdalloynanoparticles,andL-glutamateoxidase(L-GluOx)forthespecificsensingofL-glutamate(L-Glu)hasbeendeveloped.TheAu-PdalloynanoparticleswerecoatedontheH-RGOmodifiedglasscarbonelectrodesbyelectrodeposition.Thestepwisefabricationofnanomaterialswascharacterisedbyusingscanningelectronmicroscopy(SEM),UV-Visspectraandelectrochemicalmethods.Inaddition,energy-dispersivespectroscopy(EDS)wasapplicatedtoinvstigatethechemicalcompositionsoftheAu-Pdalloynanoparticles.TheproposedbiosensorshowedgoodanalyticalperformanceindetectionofL-Gluwithawideliearrange,lowdetectionlimit,goodstabilityandexcellentselectivity.Keywords:Chiralrecognition;ECL;aminoacids;metalnanomaterials;functionalizedcarbonmaterialsIV 第1章绪论第1章绪论1.1手性及手性识别研究意义1.1.1手性和手性识别定义手性（chirality）是自然界存在的普遍现象和基本属性，被LordKlevin阐述为“分子或化合物与其镜像不能重合的特性”。分子或化合物互为实物与镜像的关系也被称为“対映关系”，而具有这种关系的物质间互为“对映体”[1]，如图1-1所示。图1-1一对对映异构体生命体内的有机化合物大多具有手性，但是在生命体产生和漫长的演变过程中，自然界往往对一种手性构型有所偏好，如组成多肽的天然氨基酸（除甘氨酸外）均为L-型，而组成核酸和多糖的单糖为D-型，DNA和蛋白质的螺旋方向是右旋等[2]。自然界中D-氨基酸和L-单糖的含量极少，此外，其它许多天然手性小分子也主要以一种手性构型存在，这是自然选择的结果。生命现象中的多数化学过程都与立体化学密切相关，如手性分子与外部手性环境之间存在特定的选择性作用，使得对映体呈现不同的生理活性，这种现象可称之“手性识别”[3-4]。它可被形象地比喻为手与手套间关系，即右手能套进右手套，不能套进左手套，如图1-2所示。图1-2手与手套的关系——“手性识别”1 西南大学硕士学位论文1.1.2手性识别的研究意义手性识别现象普遍存在于自然界，如酶的高度立体专一性、手性药物在人体内代谢等。因此，手性识别研究在医药学、生命科学、食品科学、材料科学等领域都具有极其重要的研究价值[5,6]。手性药物是指含有不对称碳原子的一类药物，通常只含有有效对映异构体或以有效对映异构体为主。在生物体内，互为对映异构体的药物常常表现出截然不同的生物活性、药效、毒性和代谢过程，这种现象是由手性药物与生物分子间严格的立体选择性匹配造成[7]。因此，在医药学研究领域方面，手性识别研究具有重大的临床意义。生命有机体是由不对称化合物组成的复杂而庞大的手性系统，对手性识别现象的研究有助于人们进一步认识和了解生命体系。生物分子，如DNA、RNA、蛋白质、多糖和激素等，大多数具有手性。生物体内的代谢过程涉及大量的手性识别作用，如蛋白酶的立体选择性催化作用，核酸的碱基互补配对作用等。在生命科学领域，手性识别研究有助于人们进一步了解生命起源、阐述生命过程本质，更有利于研究手性分子或化合物在人体内的生理活性或代谢过程。俗语说：“民以食为天”，可见食品安全对人类尤为重要。随着科技的发展进步，各种手性食品添加剂的应用为人类饮食带来极大便利，如使食品长时间保鲜、味道更鲜美等。与此同时，食品安全问题也引起了人们的重视。其中，手性对映异构体的纯度和含量是食品质量和污染的重要考察指标[8]。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，为了维持人体正常代谢，常常需要通过食物或药物摄入一定量的氨基酸，而不同的氨基酸对映体具有不同的作用，例如L-谷氨酸常作为鲜味剂，而D-谷氨酸却不具有鲜味。此外，一种对映异构体氨基酸可被人体代谢吸收或降解，但另一种则无法被代谢或排出体外，若聚积在体内则可能引起持久性危害，例如D-氨基酸是细菌细胞壁的重要组成成分，是衡量食品污染的重要指标[9,10]，会给人体健康带来威胁。由此可知，手性识别研究对监测食品质量和安全具有十分重要的意义。近年来，具有特殊性能的手性材料，如高分子材料、光电磁材料、生物智能材料、液晶材料等，引起了广大研究者的关注。手性高分子材料与无旋光性的高分子材料相比，在溶解度、力学性能、光学性能和电学性能方面具有更优良的性能，因此有望通过在高分子聚合物中引入手性，以获得具有特殊性能的新型手性高分子材料。同时，手性液晶材料成为近年来的研究热点，它拥有螺旋扭曲结构，具有对光线选择性反射特性和独特的电学性能，在信息记录以及存储领域具有广阔的前景[11,12]。2 西南大学硕士学位论文综上所述，手性识别研究在医药、生命科学、食品科学及材料科学等领域中具有重要理论和实际意义。1.2手性识别方法目前，色谱法、光谱法、电化学方法等被广泛应用于手性对映异构体的定性和定量分析，并取得了一定的研究进展。1.2.1色谱法色谱法是一种发展较为成熟的物理化学分离方法，能有效分离性质相近的多组分混合物，被广泛应用于手性识别研究。手性色谱分离对映异构体一般采用直接法和间接法两种方式。直接法手性分离是利用手性固定相或者手性选择剂进行对映异构体分离，而间接法是通过两种对映异构体与手性衍生化试剂生成物理化学性质不同的两种物质，并进一步在非手性固定相上分离。色谱法可细分为毛细管电泳法（CE）、高相液相色谱法（HPLC）、气象色谱法（GC）、超临界色谱（SFC）以及薄层色谱（TLC）等。毛细管电泳法（capillaryelectrophoresis，CE）是以高压直流电场为驱动力，利用对映异构体与手性选择剂形成具有不同的稳定常数的结合物，导致迁移率不同，从而达到手性对映体分离的目的。手性选择剂的使用在对映体的分离与拆分方面至关重要，常用的有环糊精及其衍生物、手性冠醚、多糖、大环糖肽类抗生素、金属配体化合物等。Noszál等人[13]以环糊精修为手性选择剂，应用毛细管电泳法成功将阿塞那平马来酸盐对映异构体分离开来。Verleysen等人[14]设计合成了18-冠-6-四羧酸填充的毛细管柱，在酸性条件下，可以实现对α-天冬氨酰肽和β-天冬氨酰肽对映体的有效分离。陈等人[15]以一种支链多糖（糖原）为手性选择剂（结构如图1-3所示），采用毛细管电泳技术可将12种碱性药物和6种酸性药物成功分离。高效液相色谱技术（high-performanceliquidchromatography,HPLC）在直接分离对映体方面具有选择性高、速度快等优点，已经用于分离分析上万种手性化合物对映体。Walker等人[16]以Chiralpark手性固定相，采用高效液相色谱法有效拆分奥昔布宁对映体，并考察了缓冲盐体系种类、流动相pH以及流速对分离效果的影响。Allnemakr等人[17]以与硅胶键合的牛血清白蛋白（BSA）作为固定相，成功地将一系列具有不同的苯酞基和萘酞基的氨基酸对映异构体分离开来，具有较高的对映选择性和拆分效果。Mskhiladze等人[18]研究了以多糖为手性选择剂的手性填充柱对10种手性抗真菌药物的分离与拆分效果，并重点探讨了手性选择剂、实3 西南大学硕士学位论文验温度和流动相添加剂对多种对映异构体洗脱顺序的影响。图1-3手性选择剂-糖原结构式[18]1.2.2光谱法光谱分析法在手性识别方面具有良好的应用前景，它可以有效监测手性选择剂与不同对映体混合时产生的不同光谱信号变化，以达到对手性物质的识别与拆分的目的。近年来，常用于手性分析的光谱技术主要有圆二色谱（CD）、紫外-可见光谱（UV-Vis）、红外光谱（IR）、荧光分析法（FL）、核磁共振（NMR）和质谱（MS）等方法。Bari等[19]设计了一种基于2-甲酰基-3-羟基吡啶和Fe(II)(TfO)2的传感体系，应用圆二色谱技术研究与α-手性一级胺对映体的相互作用。在该实验过程中，2-甲酰基-3-羟基吡啶能和手性胺类快速反应生成具有供电子能力的手性化合物，该化合物能够与Fe2+形成一类具有旋光性八面体配合物，该八面体配合物在紫外-可见光区具有圆二色性，手性识别过程如图1-4所示。Ye等人[20]制备了核苷酸包裹的银纳米颗粒，并将之用于半胱氨酸对映体的手性识别。该纳米颗粒能够选择性地与D-半光氨酸反应，产生灰色沉淀，从而实现对半胱氨酸对映体的快速手性识别，并进一步采用紫外-可见分光广度计进行线性测试。吕等人[21]在L-谷胱甘肽为还原剂和稳定剂的条件下，采用微波辅助法制备了一种超微水溶性荧光银纳米簇，以该手性纳米簇为荧光探针，能够实现半光氨酸对映体的快速识别与检测。Cecilia等[22]运用1HNMR技术研究了N-2-十二酰基-L-脯氨酸钠等阴离子微胶粒与色氨酸二聚体对映异构体之间的对映选择性行为。质谱（MS）常与其它分析方法（如高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳技术、紫外-可见光谱等）联用以达到手性分析目的，这是因为对映体具有相同分子质量和完全相同的质谱分析图，无法实现单一质谱法手性分离[23]。4 第1章绪论图1-4圆二色谱法手性识别研究示例[19]图1-5紫外-可见法手性识别研究示例[20]1.2.3电化学法电化学传感器能快速、实时、在线地测定对映异构体的纯度及含量，且仪器设备操作简单，环境污染小等，日益受到手性识别研究者的关注。它利用手性选择剂和对映异构体相互作用产生的差异(包括所有分子间的作用如氢键、电荷转移效应、偶极相互作用、立体效应、配位效应及疏水作用等)，并将这种差异转换为电信号变化而达到手性识别目的。根据转换的电信号不同，可以将手性电化学传感器归为电流型、电位型及电阻型手性传感器。电流型手性传感器是基于对映体与手性传感界面相互作用后会改变电极表面性质，从而产生不同的电流信号差异，实现手性识别目的。目前，对电流型手性传感器研究较多。如孔等[24]采用化学聚合法在裸玻碳电极上修饰上L-谷氨酸，利用分子间氢键作用自组装上β-环糊精，采用差分脉冲伏安法研究该手性传感界面与色氨酸对映体之间的对映选择性作用，实验结果表明色氨酸对映体在该传感界面产生明显不同的电流信号，从而达到手性识别目的。Kim等[25]通过在表面活性剂（聚氧乙烯烷基醚）和手性模板分子（左旋多巴）共存的条件下，利用电聚合技术制备手性分子印迹膜，也可称为手性介孔铂。实验结果表明，该手性分子印迹5 西南大学硕士学位论文膜具有较好的稳定性、重现性和对映选择性，能够实现对多巴对映体的手性识别。电位型手性传感器是基于手性选择剂与对映异构体作用后Gibbs自由能变化的不同，能在不同的电位值下产生电信号响应，从而达到手性识别与检测的目的。郭等[26]在玻碳电极上电聚合L-半胱氨酸，应用差分脉冲伏安法研究了该手性传感器与酪氨酸对映体之间的相互作用，实验结果表明酪氨酸对映体能够在不同的电位值下产生电流响应，从而达到电位识别的目的。孔研究小组[27]在酸性条件下，利用1，3-丙烷磺内酯和壳聚糖反应合成磺化的壳聚糖，并利用恒电位沉积法将磺化的壳聚糖聚合在玻碳电极表面，制得仿DNA双螺旋结构的纳米材料，该手性传感界面能够实现对色氨酸对映体的电位型手性识别。电阻型手性传感器是基于对映体与手性传感界面发生作用后，电极表面性质发生改变，通过监测电极表面电荷转移速率发生的不同变化，可达到手性识别目的。本课题组[28]设计了一种基于丝氨酸衍生物、苝四甲酸、硫堇的手性传感界面，并采用交流阻抗技术研究了它对赖氨酸对映异构体相互作用。结果表明，该传感器能够实现对赖氨酸对映异构体的手性识别。1.2.3电致学发光法电致化学发光(Electrochemiluminescence，ECL)，是通过电极对含有电致化学发光探针体系施加一定的电压或通过一定的电流，使得电极氧化还原产物之间或电极氧化还原产物与体系其它共存物质之间会发生化学反应并生成某种不稳定的激发态，由激发态返回到基态产生的发光现象[29]。电致化学发光技术作为化学发光与电化学有效结合的一种分析方法，除兼具二者的优势，还具有因二者结合产生的新优势，如操作简单、选择性好、灵敏度高、动力学响应范围宽、连续可测等，越来越受到研究者的青睐[30,31]。电致化学发光传感器是由探针、光纤、电解池、暗箱构成，它在生物医学，临床检验，环境检测，食品分析等领域应用广泛[32-34]。近年来，电致化学发光传感器在手性识别方面呈现蓬勃发展的趋势，如赵等[35]研究了相同条件下，检测池中三联吡啶钌和氨基酸对映异构体发生相互作用时，可产生明显不同的电化学发光信号，并进一步研究了氨基酸与联吡啶钌发光机理，结果证明环状氨基酸都能够在该测试条件下实现手性识别目的。同时，赵等[36]设计构建了壳聚糖包埋三联吡啶钌/二氧化硅修饰铂电极，并研究了脯氨酸对映异构体在该修饰电极表面的电化学发光信号响应，结果表明在0.85V处，产生最大的峰信号差异值。曲等人[37]将巯基化的ds-DNA键合到金电极表面，该单链DNA能与发光探针[Ru(phen)2+3]结合。当构建的手性传感器与手性超分子金属配合物相互作用时，其中一种手性构6 第1章绪论型能够嵌入到ds-DNA的绕旋结构中，产生较强的信号响应，而另一种构型无法使ds-DNA形成绕旋结构，产生较弱的信号响应。如此设计的传感界面能够有效地识别手性超分子金属配合物对映异构体，其原理图如1-6所示。图1-6电致化学发光法手性区分超分子金属配合对映异构体原理示意图[37]1.3重要的发光体系近年来，已经研究发现的电致化学发光物质有多种，但是到目前为止，研究较为成熟且应用最广泛的电致化学发光体系主要分为联吡啶钌及其衍生物体系、鲁米诺体系和纳米粒子体系等，本文简单介绍联吡啶钌及其衍生物体系、鲁米诺体系。1.3.1Ru(bpy)2+3发光体系及其发光机理由于Ru(bpy)2+3发光体系具有稳定性强、发光效率高、激发态寿命长、水溶性好、可进行可逆单电子转移反应、检测灵敏度高和线性范围宽等优点，使其在电化学发光理论研究和分析应用研究中具有重要的研究价值。联吡啶钌的发光机理主要分为湮灭型发光机制和共反应试剂型发光机制。湮灭型发光是通过电极施加双阶跃脉冲电压，Ru(bpy)2+3本身分别被氧化和还原为氧化态和还原态，随后，它的氧化态和还原态离子发生湮灭反应而产激发态中间体，当激发态跃迁回基态时以光的形式释放电致化学发光信号，如图1-7所示7 西南大学硕士学位论文[38,39]。图1-7联吡啶钌湮灭型发光机制[38,39]对共反应试剂型发光机制的研究相对较多。当对工作电极施加单一方向电压时，检测底液中存在可以产生具有强氧化性或者强还原性的中间体，中间体能够和Ru(bpy)2+3发生进一步反应产生激发态分子，由激发态跃迁至基态的过程中伴随着电致化学发光信号产生。Ru(bpy)2+2-2-3的共反应试剂有多种，如胺类、C2O4、S2O8等。Ru(bpy)2+[40,41]3与氨基酸的反应机理如图1-8所示。图1-8联吡啶钌共反应试剂型发光机制[40,41]1.3.2luminol发光体系及其发光机理鲁米诺（luminol）具有稳定性好、价格低廉、发光效率高、激发电势低及反应可在水相进行等优点，使得它在生物分析方面具有良好的应用前景。H2O2是鲁米诺发光体系的经典共反应试剂，能够极大地增强发光探针的信号响应，同时也8 第1章绪论是许多生物活性物质（如氨基酸、葡萄糖、乳酸和胆碱等）及其相应酶的代谢产物。在碱性条件下，鲁米诺的发光过程中脱氢反应得以进行[42]，具体过程如图1-9所示。图1-9鲁米诺在碱性溶液中的电致化学发光机理[42]1.4贵金属纳米材料在电致化学发光传感器中的应用贵金属纳米材料主要指Pt、Pd、Au、Ag等金属元素构成的纳米材料，由于具有金属良好的导电性、导热性和纳米材料的通性，引起了众多研究者浓厚的兴趣[43-45]。随着科技的进步，金属纳米材料在催化、光学、电子、传感及生物医学等重要领域得到了广泛的应用。金属纳米材料表面具有很多不饱和配位的活性原子，能够与具有巯基和氨基的生物小分子或其它氨基化或巯基化分子结合，并能很好维持生物分子的活性。此外，贵金属纳米材料具有较好的电催化活性，可广泛应用于电致化学发光传感器的制备，以实现对电致化学发光探针的信号放大，提高传感器的灵敏度。如蒲等[46]制备了一种能灵敏检测产气荚膜梭菌的新型夹心免疫传感器，首先将还原氧化石墨烯固载在丝网印刷电极上，并进一步采用阳离子交换膜Nafion处理修饰电极，紧接着在荷负电的修饰电极表面上固载上钌-铂纳米复合材料，并利用铂良好的生物相容性，固载葡萄糖脱氢酶（可原位产生共反应试剂NADH）和一抗，并孵育上目标抗原，该抗原可与纳米金@四氧化三铁纳米材料标记的二抗作用，以进一步放大ECL信号响应。在这个过程中，纳米铂和金可以很好固载抗体，并对Ru(bpy)2+3的电致化学发光信号具有极强的增敏作用，传感器构建示意图如1-10所示。卓等[47]利用鲁米诺为还原剂，合成了luminol-Pt@AuNFs，并以此复合材料标9 西南大学硕士学位论文记二抗和吸附信号放大酶（乙酰胆碱酶）。电极的构建过程如下：二氧化锰纳米颗粒和碳纳米管的复合材料可作为固载基质被滴涂在金电极表面，随后在其表面修饰上一抗，并孵育上目标抗原，该抗原能够与luminol-Pt@AuNFs标记的二抗特异性结合，制备得到夹心免疫传感器。在这个体系中，luminol-Pt@AuNFs不仅可以充当固载乙酰胆碱酶的良好基质，也可以放大鲁米诺的ECL信号，传感器的制备过程如1-11所示。图1-10基于PtNPs构建的电致化学发光免疫传感器[46]图1-11基于Pt@AuNFs构建的电致化学发光免疫传感器[47]1.5功能化碳纳米材料电致化学发光传感器中的应用近年来，碳纳米材料（包括富勒烯、碳纳米管、石墨烯、介孔碳等）引起人们的广泛关注。其中，最具代表性的碳纳米材料是石墨烯和碳纳米管。石墨烯是一种具有二维平面结构的碳纳米材料，它以sp2杂化轨道组成六角型呈蜂巢状的晶10 第1章绪论格平面薄膜结构[48]，是迄今为止发现的力学性能最好的材料之一。碳纳米管，主要由呈六边形排列的碳原子构成的数层到数十层的同轴圆管组成，可根据层数分为单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）[49]。石墨烯和碳纳米管独特的电子结构决定了它们具有较大的比表面积、良好的导电性、高机械强度、易于修饰和生物相容性好等优良性能，使其在电化发光学检测和分析中展现出独特的优势，它可用于灵敏性好、选择性高、低检出限的电致化学发光传感器的构建。但是，石墨烯和碳纳米管的水溶性较差，不易在溶剂分散均匀，这极大地限制了它们的应用。因此，人们采用多种方法对石墨烯和碳纳米进行化学修饰、掺杂、改性，或与其它纳米材料进行复合，制备得到功能化碳材料[50-52]，极大地丰富了碳材料在电化学发光传感器中的应用。碳材料在电化学发光传感器的作用可体现在以下几个方面：①比表面积大，可充当固载基质。②具有良好的电催化性能，可以加快电子传递，增强传感器信号响应。③可与其它纳米材料结合制备得到功能化的纳米复合材料。1.6本文研究思路纳米材料在电致化学发光传感器的制备与信号放大方面具有巨大的应用潜力。碳纳米材料可以通过掺杂、修饰、改性等多种方法，进一步扩展了它的应用领域，而贵金属纳米材料具有良好的生物相容性、稳定性、电催化性能及形貌可控性。本文采用金属纳米材料和功能化碳材料构建具有手性识别功能的电致化学发光传感器，以用于氨基酸对映异构体的识别与检测。主要内容如下：1.本文制备了金-钌纳米复合材料（Ru-AuNPs）和β-环糊精-还原氧化石墨烯纳米复合材料（β-CD-rGO），并在超声工艺辅助下将二者均匀分散在Nafion溶液中，制得兼具电致化学发光性能和立体选择性的纳米复合杂化材料，用电致化学发光技术研究该纳米杂化材料修饰电极与D-或L-脯氨酸的相互作用。实验结果表明，该纳米复合杂化材料与D-脯氨酸的作用更强，产生更大的ECL信号。2.由于D-氨基酸氧化酶（DAAO）可以立体选择性地催化D-氨基酸分解，并产生鲁米诺的共反应试剂H2O2，因此该体系以鲁米诺为发光探针监测ECL信号。实验中，将功能化多壁碳纳米管（F-MWCNTs）滴涂在电极表面，用电化学沉积法制备金铂纳米合金材料（Au-PtNPs），并在其表面孵育上D-氨基酸氧化酶，得到D-氨基酸氧化酶/金铂纳米合金材料/羧基化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极。在L-氨基酸共存条件下，采用电致化学发光法研究该传感器对一系列D-氨基酸的信号响应大小。实验结果表明，该传感器能够对D-丙氨酸具有更好的响应，且具有良好的选择性、灵敏性、稳定性和低检测限。11 西南大学硕士学位论文3.为了实现特定构型氨基酸的高选择性检测，我们制备了基于L-谷氨酸氧化酶（L-GluOx）的电致化学发光传感器。检测原理是基于L-谷氨酸氧化酶能够对映选择性地催化L-谷氨酸，产生鲁米诺发光体系的共反应试剂H2O2，而D-谷氨酸或其它氨基酸均不能被催化分解。同时，为了获得高灵敏度，我们制备了氯化血红素功能化的石墨烯（H-RGO）和金钯纳米合金材料（Au-PdNPs），不仅可以很好地固载L-谷氨酸氧化酶，也可以增强鲁米诺电致化学发光，采用电致化学发光技术考察了L-GluOx/Au-PdNPs/H-RGO修饰电极在含有L-或D-谷氨酸或其它氨基酸溶液中的ECL信号响应，结果表明，该传感器仅能对L-谷氨酸有很好的特异性响应，D-谷氨酸和其它氨酸均不会造成干扰，且具有选择性好、灵敏度高、稳定性好、线性响应范围宽和检测限低等优点。12 第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究2.1引言手性是自然界重要的基本属性之一，手性识别在研究生物分子间相互作用方面扮演着举足轻重的角色[53]。氨基酸作为构成多肽的基本组成单元，也具有手性[54]。此外，氨基酸对映异构体具有相同的物理、化学性质，却可能表现出截然不同的生理、生化特性。例如，L-脯氨酸是中枢神经系统中一种重要的神经调节剂或神经递质[54]，而哺乳动物体内D-脯氨酸却可能引发肝脏门静脉周围纤维化、肝细胞坏死或严重的近端肾小管萎缩坏死[56,57]。因此，采用有效的方法进行脯氨酸对映体的识别与检测就显得极其重要。近年来，电致化学发光法（ECL）已经发展成为一种非常重要和有效的分析方法。它具有选择性好、灵敏度高、仪器简单、良好的可控性等优点，现已被广泛应用于生物、化学分析等领域[58-62]。在电致化学发光体系中，三联吡啶钌（Ru(bpy)2+3）反应机理简单，在水溶液和有机溶液中发光效率高、溶解度好，使得它的应用最为广泛[63]。同时，大量的研究发现，与液相电致化学发光体系相比，联吡啶钌固相的电致化学发光体系不需要持续向传感器附近提供共反应试剂，使得操作起来更方便、仪器更简单化，而且也可降低昂贵试剂的消耗量、再生性更好，更易于实现电致化学发光反应在时空上的控制[64-66]。目前，一些表面带负电荷的金属纳米粒子可以和带正电的Ru(bpy)2+3通过静电作用形成纳米复合物从而实现Ru(bpy)2+[67-72]3在电极上的固载。石墨烯，具有较高的比表面积、低成本、高导电率等优良性能[73]，使其在许多技术领域具有极大的应用价值[74,75]。为了充分利用石墨烯的性能，大量的化学修饰、掺杂法被用于石墨烯性能的改良[76,77]。相应的，基于石墨烯的电致化学发光传感器具有响应速度快、稳定性好、发光强度大等优点[78,79]。手性识别的关键是手性界面材料的制备，而构建有效的手性传感界面的方法有多种[80]。β-环糊精（β-CD）是由七个D-吡喃葡糖糖单元通过α-1，4-糖苷键连接而成的环状低聚糖，具有外亲水内疏水结构，其疏水空腔可以通过非共价键作用包络与其腔体形状、大小适宜的客体分子，形成主-客体包埋复合物，可实现对有机分子、无机分子和生物分子等的识别，因此它被广泛用作手性选择剂，用于构建手性传感界面[81,82]。而ECL技术对氨基酸对映体或手性药物手性识别研究鲜见报道[34-36]。本文通过制备联吡啶钌-金纳米粒子纳米复合材料和β-环糊精-还原氧化石墨烯纳米复合材料，研究该纳米杂化材料与脯氨酸对映异构体间的作用。13 西南大学硕士学位论文2.2实验部分2.2.1试剂与材料二氯三（2，2'-二吡啶）合钌（II）六水合物（Ru(bpy)3Cl2·6H2O）购于苏州纳凯科技（中国，苏州）；β-环糊精（β-CD）购买于阿拉丁试剂公司（中国，上海）；L-脯氨酸（99%）和D-脯氨酸（99%），氯金酸（HAuCl4），Nafion（5%）购买于百灵威试剂公司（中国，北京）；氧化石墨烯（GO）购买于南京纳米先锋科技有限公司（中国，南京）；浓氨水（25–28%），柠檬酸三钠，磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠（Na2HPO4）和氯化钾（KCl）购于北碚试剂厂（中国，重庆）。实验前制备0.1mol·L-1不同pH值磷酸缓冲液（PBS）。其余化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。所有实验用水均为二次蒸馏水，所有实验均在室温下进行（25±0.5°C）。2.2.2仪器所有电化学发光测试和电化学测试分别在MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应化所）和CHI604D型电化学工作站（上海辰华仪器公司）上操作完成。标准三电极体系中，饱和银/氯化银电极（Ag/AgCl）作为参比电极，铂丝电极作为对电极，玻碳修饰电极作为工作电极；扫描电子显微图像是在扫描电子显微镜（S-4800，日本HitachiInstrument公司）测试得到；拉曼光谱数据由共焦激光拉曼光谱仪（中国，上海，KENISHAW公司）测得；红外光谱数据来自傅里叶变换红外光谱仪（美国，Perkinelmer公司）。2.2.3纳米金及Ru-AuNPs复合纳米球的制备实验中使用的玻璃器皿均用王水和蒸馏水冲洗干净。纳米金溶胶的制备参照文献[83]。首先，1mLHAuCl4溶液（1wt%）稀释至100mL，加热煮沸，然后在不断地搅拌下加入3mL柠檬酸三钠溶液（1%），将得到的混合溶液保持沸腾30min。溶液的颜色逐渐变深，得到酒红色的溶液，冷却至室温，通过透射电子显微镜（TEM）进行表征，其粒经约为12nm（图略）。将5mL制备的纳米金溶胶，在强力搅拌的条件下缓慢加入2mLRu(bpy)2+3溶液（0.2mg·mL-1），几分钟后，产生大量黑色的沉淀（Ru-AuNPs），通过离心收集沉淀，超声分散制备成悬浮液[84]，置于4ºC下备用。14 第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究2.2.4β-CD–rGO纳米复合材料的制备β-环糊精-还原氧化石墨烯（β-CD–rGO）纳米复合材料的制备是参照文献[85]。制备过程简述如下：5mL超声分散均匀的氧化石墨烯溶液（GO，0.5mg·mL-1）和5mLβ-环糊精（β-CD，80mg·mL-1）充分混合均匀，并在剧烈搅拌下加入75µL氨水和5µL水合肼。随后将混合液置于60ºC水浴条件下，继续搅拌反应3.5小时，最终可得到黑色分散均一的混合液。离心、洗涤、收集产物，重新分散到5mL蒸馏水中，在4ºC下储存备用。2.2.5修饰电极的构建将得到的Ru-AuNPs纳米复合材料和β-CD–rGO纳米复合材料与2.5%的Nafion溶液充分混合均匀，得到兼具电化学发光性能和手性的纳米复合杂化材料（简称CGRA）。在电极修饰之前，将玻碳电极（GCE，Φ＝4.0mm）依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉处理，并分别在蒸馏水和乙醇中超声洗涤，自然晾干。随后，在经抛光打磨清洗过的裸玻碳电极表面滴涂10µLCRGA纳米杂化材料，并置于室温下自然晾干，得到CGRA/Nafion/GCE修饰电极。2.3结果与讨论2.3.1不同纳米材料的光谱特性和表面形貌拉曼光谱（Ramanspectroscopy）被广泛应用于研究晶体的有序或无序结构，在图2-1A中，曲线a显示石墨烯在1580cm-1处有典型的G吸收带，此峰对应一阶的散射E2g碳原子面内振动，用来表征碳的sp2键结构，而1352cm-1处的小峰可用来表征石墨烯缺陷度[86]。曲线b中的氧化石墨烯的拉曼G峰红移到1595cm-1处，且峰形较宽，而在1352cm-1处出现的拉曼D强吸收峰表明sp2碳原子平面的折叠，这是由于石墨烯的强氧化[87]。与氧化石墨烯相比，曲线c中的β-CD–rGO拉曼G峰和拉曼D峰依然存在，但拉曼D峰与G峰的强度比值发生变化。这些变化表明，氧化石墨烯经过还原后，sp2碳原子分子域减小，而还原氧化石墨烯的无序性增强，这表明β-CD–rGO中有许多新的石墨结构域生成[85,88]。用扫描电子显微镜（SEM）考察纳米材料的表面形貌。图2-1B显示了Ru-AuNPs纳米材料呈聚集状，这是由于Ru(bpy)2+3和荷负电的纳米金之间的发生的静电作用。图2-1C显示了CGRA纳米复合杂化材料的表面形貌有明显改变：可以看到大量的Ru-AuNPs复合材料附着在褶皱的β-CD–rGO表面，说明具有高比表面积的还原氧化石墨烯可作为固载Ru-AuNPs的良好基底。15 西南大学硕士学位论文图2-1（A）石墨烯(a)、氧化石墨烯（b）和β-环糊精-还原氧化石墨烯（c）的拉曼光谱;（B）Ru-AuNPs的SEM表征；(C)CGRA纳米杂化材料的SEM表征2.3.2反应机理探讨氨基酸可以参与到Ru(bpy)2+3的电致化学发光反应中，充当它的氧化-还原型共反应试剂，能够极大地增强Ru(bpy)2+3电致化学发光信号。脯氨酸（proline）和Ru(bpy)2+2+3+3之间的反应机理如下：在电极表面，Ru(bpy)3被氧化为Ru(bpy)3（见方程式（1）），而在缓冲溶液pH值为8.5的条件下，荷负电脯氨酸（等电点6.3）[89,90]则被氧化为一种自由基（见方程式（2））[91,92]。如方程（3）和（4）所述，产生的自由基经过脱质子的过程生成中间态的自由基，该自由基可以与Ru(bpy)3+3反应产生激发态的Ru(bpy)2+*2+*3。当激发态的Ru(bpy)3跃至到基态的过程中，释放ECL信号[93-95]。接下来，脯氨酸的副产物的氨基在水溶液中可发生脱烷基化，产生二级胺[94,96,97]。Ru(bpy)2+2+[91,98,99]3-proline间的反应机理和Ru(bpy)3-TprA类似。16 第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究在本研究中，脯氨酸对映异构体作为目标分析物参与到产生ECL信号的过程中，且对Ru(bpy)2+3发光具有极强的增强作用。如图2-2所示，当检测底液中不含脯氨酸时，Ru(bpy)2+2+3产生ECL信号急剧减小，可以进一步证明基于Ru(bpy)3为发光探针的ECL传感器具有检测脯氨酸的可行性。2-2修饰电极表面的电致化学发光反应机理图2.3.3电致化学发光法手性识别脯氨酸对映异构体基于上述理论，将修饰电极置于含有5.0mmol·L-1D-脯氨酸或L-脯氨酸的磷酸盐缓冲溶液中，并在0.2-1.25V的电压范围内扫描测试。如图2-3A所示，D-脯氨酸（曲线a）和L-脯氨酸（曲线b）的ECL信号强度间存在较大差异，且D-脯氨酸的ECL信号强度明显大于L-脯氨酸。这种ECL信号差异源于纳米材料之间的协同作用。研究了β-环糊精在手性识别中的作用，没有环糊精时，不仅ECL信号强度较小，而且D-脯氨酸与L-脯氨酸无法产生明显的信号差异。证明β-环糊精在该体系中充当手性选择剂，是脯氨酸对映异构体体ECL信号差异产生的主要原因。β-环糊精可以选择性地将脯氨酸对映体捕捉到它的腔体内，与电极上的Ru(bpy)2+3发生反应，产生可检测的ECL信号，这也能解释环糊精的缺失而造成的ECL强度下降[100,101]。此外，它还是石墨烯较好的分散剂，可以提高石墨烯的水溶性[102,103]。因此，石墨烯和环糊精的结合不仅能够提高石墨烯材料的水溶性，也能提高它的电致化学发光传感性能[85,88]。17 西南大学硕士学位论文60005000AaB4000b30002000E1000bCaL0inten0.30.60.91.21.50.30.60.91.21.5sityPotential/VPotential/V/a.u.2-3D-脯氨酸（a）和L-脯氨酸（b）在不同电极表面的ECL信号响应曲线A.CGRA/Nafion/GCE,B.GRA/Nafion/GCE2.3.4手性识别机制研究a1154b334311301348138416301630c3324T3341ransm01000200030004000itta-1)Wavenumber(cmnce2-4不同材料的红外光谱特征吸收曲线(a.ua.CGRA,b.D-Pro/CGRA,c.L-Pro/CGRA.)手性识别机制或可归因于多重分子间作用力，如氢键、偶极和空间位阻。当脯氨酸与环糊精形成包络物时，脯氨酸分子上的极性内氨基（-NH-）可与β-环糊精环上的羟基（-OH）形成氢键[56,101,104]。而且，D-或L-脯氨酸与β-环糊精的结构单元D-葡萄糖上手性碳原子间存在的立体选择性作用在手性识别中扮演着重要的角色[105]。红外光谱用来考察脯氨酸与构建的手性表面之间的氢键作用力[106]。如图18 第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究2-4所示，CGRA纳米材料（曲线a）和L-脯氨酸/CGRA纳米材料（曲线c）的O-H的伸缩峰分别在3343cm-1和3341cm-1，而D-脯氨酸/CGRA纳米材料（曲线b）的O-H的伸缩峰红移到3324cm-1[85,107]。从分子水平的角度上看，当分子间有氢键形成时，O-H的伸缩峰出现典型的红移[108]。实验结果表明，D-脯氨酸能与手性传感界面形成更多氢键。在这种情形下，L-脯氨酸的-NH-基不利于形成氢键，也就不利于L-脯氨酸与手性传感界面之间的作用，从而产生手性识别差异。2.3.5pH的影响缓冲液的pH值对ECL光强度与修饰电极的灵敏度具有较大的影响。OH-能够参与到Ru(bpy)2+3和proline之间的化学反应中，因此选用pH范围6.0-10.0进行研究。如图2-5所示，在缓冲溶液的pH为8.5时，能够获得最高的ECL信号强度与最佳手性识别效果。因此，8.5被选为实验的最佳pH值。6000a4500b30001500ECL0inte678910nspHity/a.u图2-5pH优化.2.3.6手性选择传感器的应用研究了该传感器在优化条件下对一系列浓度的脯氨酸对映体（1.0×10−4-5.0×10−3mol·L-1）的ECL信号响应。如图2-6所示，该传感器的ECL信号强度随着脯氨酸对映异构体的浓度的增加而增强，且在1.0×10−4-5.0×10−3mol·L-1的浓度范围内，ECL信号强度与proline浓度呈线性关系，其线性方程分别为ID-=66.86+1056.86c和IL-=73.84+805.46c，并且对D-脯氨酸具有更好的信号响应。19 西南大学硕士学位论文60006000ya=66.86+1056.86x500024000R=0.9993g30004500a2000a1000ECL0inbt0.30.60.91.21.5en3000Potential/Vsity/a.u6000.5000150040003000g2000EaCyb=73.84+805.46x1000EC0L2L0iiR=0.9991nt0.30.60.91.21.5enPotential/Vnsityte/-10123a456.un.s-1itcproline/mmol·Ly/a.u图2-6脯氨酸对映体的标准曲线.a.D-脯氨酸,b.L-脯氨酸2.3.7传感器的稳定性与重现性为了考察该手性传感器的稳定性，将该修饰电极在D-或L-脯氨酸中连续扫描11圈，结果如图2-7所示，ECL信号强度没有显示出明显变化。另外取10支由相同方法制备的修饰电极，分别对同一浓度的脯氨酸标准液进行检测，得到批内测定值的相对标准偏差（RSD）小于4.9%。以上结果表明，该传感器具有令人满意的稳定性和重现性。6000ab5000400030002000EC1000Lin0tens050100150200250050100150200250ityTime/sTime/s/a.u.2-7传感器的稳定性a.D-脯氨酸,b.L-.脯氨酸20 第2章电致化学发光法手性识别脯氨酸对映体研究2.3.8手性传感器的选择性将制备好的传感器置于含有不同氨基酸对映体的检测底液进行扫描测试，其中有精氨酸（Arg），苯丙氨酸（Phe），赖氨酸（Lys），酪氨酸（Tyr），组氨酸（His），缬氨酸（Val），丙氨酸（Ala），谷氨酸（Glu），半胱氨酸（Cys），丝氨酸（Ser），色氨酸（Trp）和谷氨酰胺（Gln）。结果如图2-8所示，在脯氨酸中获得最强的ECL信号响应，这是因为脯氨酸是天然氨基酸中唯一的二级胺，对Ru(bpy)2+3发光的增强作用远远大于一级胺[109]。对于一级胺而言，它们与Ru(bpy)2+3间的发光强度大小与氨基酸ɑ-碳原子上的R基团的吸电子特性相关。Brune和Bobbitt研究表明，吸电子能力较差的氨基酸能表现出更高的发光强度[110]。这些理论能够很好地解释该传感器对脯氨酸对映体良好的选择性。6000L-D-50004000300020001000EC0LiProArgPheLysTyrHisValAlaGluCysSerTrpGlnnten2-8传感器的选择性sity2.4结论/a.u本实验借助β-C.D-rGO和Ru-AuNPs纳米复合材料构建了一种新型手性电致化学发光传感器，并将该传感器用于脯氨酸对映体的手性识别研究。结果表明，脯氨酸对映体能够参与到Ru(bpy)2+3的电化学发光反应进程中，并能够极大的促进ECL信号的增强，该传感器对脯氨酸对映体具有良好的线性响应，且对D-脯氨酸的电化学发光响应更强。此外，该传感器还具有高选择性、高灵敏度、良好的稳定性和手性识别效果。因此，该手性ECL传感器为氨基酸或手性药物的手性识别研究提供了新的视角。21 第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究3.1引言氨基酸作为生命物质的基石（除甘氨酸外）均为手性分子[111,112]。尽管手性对映体具有几乎相同的物化性质，但在生命进化的漫长过程中，L-型氨基酸被优先选择形成多肽或蛋白质[113]。然而，D-氨基酸依然存在低级物种（如微生物、细菌）和哺乳动物体内，会造成食品污染或严重损害哺乳动物健康[114-117]。因此，发展可靠、快速、有效检测D-氨基酸含量水平的分析方法成为人们不懈追求的目标。目前为止，应用于D-氨基酸含量水平的检测方法有很多种，如高效液相色谱法（HPLC）[118,119]，气相色谱[120]，毛细管电泳[121-123]，光谱法[124-126]等等。虽然这些方法具有灵敏度高、分析结果可靠、重现性好等优点，但是因它们使用的仪器相对昂贵、会耗用大量有毒试剂、操作程序较复杂，且对测试的样品有很高的要求而极大地限制了它们的发展和应用。酶生物传感器具有操作简单、检测快速、灵敏度高、特异性好等优点，有望克服这些不足[127-129]。电致化学发光（Electrochemiluminescenceorelectrogeneratedchemiluminescence，简称ECL），是通过电化学方法引发的化学发光现象。通过电极对含有电致化学发光活性物质的体系施加一定的电压或是通过一定的电流，产生了某些特殊的物质，这些特殊物质之间或这些特殊物质与体系中其他外加共存物之间发生化学反应产生一些不稳定的激发态物质，这些激发态物质由激发态回到基态以光的形式释放能量，从而产生发光的现象；或者发光活性物质直接在电极发生氧化还原反应生成某些不稳定的中间态物质，该中间态物质分解而产生化学发光现象。电致化学发光分析技术具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽、反应可控性好、时空可控性好、仪器简单、分析速度快等优点，现被广泛应用于分析化学领域。因此，基于电致化学发光分析技术和酶的生物传感器为分析目标的高灵敏性、高选择性检测提供了新的发展平台[130]。已有基于D-氨基酸氧化酶的传感器被用于D-氨基酸的检测。D-氨基酸氧化酶（DAAO）是一种黄素蛋白，能够立体选择性地催化氧化D-氨基酸脱氨基，具体过程如下：D-aminoacid+ODAAO[131-133]2+H2Oɑ-ketoacid+NH3+H2O2。在ECL发光体系中，过氧化氢（H2O2）是鲁米诺（luminol）电致化学发光的经典共反应试剂，因此通过监测luminol-H2O2的ECL信号强度大小，可以评估D-氨基酸的含量。在实际检测中，如何保持酶在储备液中的生物活性是一个需要考虑的关键因23 西南大学硕士学位论文素。通常，为了更好的保持酶活性，可以在酶的储备液中加入相应添加剂，如甘油、牛血清白蛋白等。生物分子牛血清白蛋白可作为酶的稳定剂[134,135]，而甘油的加入可以维持酶的结构，而酶结构的保持是维持蛋白质活性的关键[136-138]。此外，甘油可以防止酶在孵育过程中被晾干[139]。近年来，碳纳米材料和过渡金属纳米材料因具有比表面积大、导电性好、电子迁移率快、生物相容性好等优点，被广泛应用于酶传感器的制备[140-143]。由于独特的物理、化学性质，多壁碳纳米管引起了广大研究者的关注[144,145]，具有较大的比表面积、良好的导电性和优良的生物相容性，可用于生物传感器的构建。再者，纳米金属合金已在催化、生物传感等领域表现出比单金属纳米材料更好的催化特性[146,147]。金铂纳米合金材料（Au–PtNPs）具有良好的生物相容性和导电性，同时也能增强luminol-H[148,149]2O2的电致化学发光信号，受到人们的极大的关注。基于以上理论，我们借助功能化多壁碳纳米管（F-MWCNTs）、金铂纳米合金材料（Au–PtNPs）复合材料和D-氨基酸氧化酶制备了一种新型D-氨基酸生物传感器。在电极逐步修饰过程中，Au–PtNPs是通过恒电位沉积法生长在F-MWCNTs修饰的玻碳电极（GCE）上，而酶在电极上的固载是借助金-硫、金-氮键、氢键或静电作用[150-152]。该修饰电极在D-氨基酸的检测方面具有良好的分析性能，如低电位激发、灵敏度高、线性范围宽、稳定和重现性好等。3.2实验部分3.2.1试剂与材料D-氨基酸氧化酶（EC1.4.3，5.6U·mg-1），多壁碳纳米管（MWCNTs，直径155nm，长度1–5mm，95%），D-/L-丙氨酸（D-/L-Ala，98%），D-丝氨酸（D-Ser,99%），D-赖氨酸（D-Lys，98%），D-苯丙氨酸（D-Phe，98%）购于Sigma化学试剂公司（美国，St.Louis,MO）；四水合氯化金（HAuCl4·4H2O，99.99%）,氯铂酸六水合物（H2PtCl6·6H2O37.5%），D-精氨酸（D-Arg,98%）购买于阿拉丁试剂公司（中国，上海）；牛血清白蛋白（BSA，98%），D-半胱氨酸盐酸盐（D-Cys，98%），D-谷氨酸（D-Glu，99%），D-脯氨酸（D-Pro，99%），D-色氨酸（D-Trp，99%）购买于百灵威试剂公司（中国，北京）；磷酸二氢钾（KH2PO4）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）和氯化钾（KCl）购于北碚试剂厂（中国，重庆）。实验前制备0.1mol·L-1不同pH值磷酸缓冲液（PBS）。其余化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。实验用水均为二次蒸馏水，实验均在室温下进行（25±0.5°C）。24 第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究3.2.2仪器所有电化学发光测试和电化学测试都是在MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应化所）和CHI604D型电化学工作站（上海，辰华仪器公司）操作完成，标准三电极体系中，饱和银/氯化银电极（Ag/AgCl）作为参比电极，铂丝电极作为对电极，玻碳修饰电极作为工作电极；扫描电子显微照片和X-射线能量散射谱（EDS）光谱由扫描电子显微镜（S-4800，日本HitachiInstrument公司）测得。3.2.3功能化多壁碳纳米管的制备羧基化多壁碳纳米管的制备参照文献[153]：将购得的多壁碳纳米管在V（98%硫酸）:V（68%硝酸）=3:1的混酸中超声分散，然后置于三颈瓶中于120°C条件下搅拌回流2小时，将产物多次清洗至中性，并在真空干燥箱中于60°C烘干得到羧基化多壁碳纳米管（F-MWCNTs）。称取1mg羧基化多壁碳纳米管超声分散于2mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，得到均匀分散的功能化多壁碳纳米管分散液（0.5mg·mL-1）。3.2.4D-氨基酸氧化酶修饰电极的制备图3-1传感器制备过程示意图首先，裸玻碳电极（GCE，Φ=4mm）分别用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨抛光，依次在乙醇和二次蒸馏水中超声清洗5分钟，空气中自然晾干。25 西南大学硕士学位论文在干净的GCE上滴涂8µL的F-MWCNTs（0.5mg·mL-1），室温下自然晾干，得到修饰电极F-MWCNTs/GCE。接下来，将得到的F-MWCNTs/GCE置于含有1.0×10−3mol·L-1HAuCl−3-1-14和1.0×10mol·LH2PtCl6的Na2SO4（0.2mol·L）溶液中，施加–0.2V的恒电压电沉积，得到Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE修饰电极[154]。取10µL含有10%甘油和1%牛血清白蛋白的氨基酸氧化酶标液（1.0U·mL-1,PBS8.0）滴涂到Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE修饰电极表面，在4°C孵育过夜，制得DAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE（酶传感器的构建过程如图3-1）。3.3结果与讨论3.3.1不同修饰电极的电化学特性采用CV研究了不同修饰电极在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)4-/3-6]（pH=8.0）溶液中的电化学行为（扫速为0.1V·s-1）。如图3-2A所示，与裸玻碳电极的循环伏安特性曲线a相比，F-MWCNTs/GCE（曲线b）和Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE（曲线c）氧化还原峰电流均明显增加，且氧化还原峰可逆对称，这说明F-MWCNTs和Au-PtNPs可以增强电子的传递速率。由于酶会阻碍电子在电极表面传导，当酶被固载到电极上后，可观察到明显的峰电流降低。300Ac200abd100A0/I-100-200-300-0.20.00.20.40.6E/V图3-2不同修饰电极的CV表征（A）和EIS表征(B)aGCE,bF-MWCNTs/GCE,cAu-PtNPs/F-MWCNTs/GCE,dDAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCEEIS可用于考察电极修饰过程的阻抗变化，它揭示了修饰电极表面性质发生的改变。图3-2B是EIS技术检测结果示意图，插图为该过程的等效电路，它由有四个参数组成：Ret为电荷转移电阻，Rs为电解液的电阻，双电层电容（Cdl）和Warburg阻抗（Z[155,156][157]w），所有的电阻值由ZsimpWin软件模拟得到。图3-2B揭示了26 第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究裸GCE（曲线a），F-MWCNTs/GCE（曲线b），Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE（曲线c）和DAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE（曲线d）在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)4-/3-6]溶液中的阻抗值。经ZsimpWin软件模拟可得知，裸玻碳电极的Ret值为128.2Ω，而F-MWCNTs/GCE的阻抗值下降至59.4Ω，Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE进一步下降至17.2Ω，说明多壁碳纳米管和金铂纳米合金材料可加快电极表面电子的传导速率。当在Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE电极表面滴涂上酶后，修饰电极的阻抗值升至254.1Ω，说明酶会阻碍电子传递，导致电阻值升高。3.3.2纳米材料表面形貌采用SEM技术研究了F-MWCNTs、Au-PtNPs/F-MWCNTs和DAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs纳米复合材料的表面形貌特征。如图3-3a所示，F-MWCNTs呈现相互缠绕交织的网状结构。在图3-3b中，经电沉积法制备的金铂纳米合金颗粒均匀地分散在网状多壁碳纳米管表面，揭示了多壁碳纳米管可为合金纳米材料附着提供多重有效位点。图3-3c显示了当酶吸附到Au-PtNPs/F-MWCNTs纳米复合材料之后，纳米颗粒粒径明显增大，导电性下降，说明该纳米复合材料可以较好地固载酶。图3-3纳米材料的SEM形貌表征aF-MWCNTs,bAu-PtNPs/F-MWCNTs,cDAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs3.3.3不同HAuCl4/H2PtCl6摩尔比的合金材料的形貌表征为了研究HAuCl4和H2PtCl6摩尔比例不同时，贵金属纳米材料表面形貌的变化，将共同制备的F-MWCNTs/GCEs置于0.2mol·L-1Na2SO4溶液（含有总浓度为2.0×10−3mol·L-1HAuCl4和H2PtCl6）中恒电位（-0.2V）沉积200s。图3-4展示了金、金-铂合金、铂纳米颗粒的扫描电子显微镜下的纳米微观结构，可以观察到，金属纳米材料均匀地附着在网状F-MWCNTs表面，其中金纳米呈现美丽的花状（图3-4a）。同时，金铂纳米合金材料和铂纳米材料呈现表面粗糙的球状（图3-4b-e），27 西南大学硕士学位论文而金铂纳米合金材料的纳米尺寸大于单金属纳米材料。图3-4不同摩尔比例下的金、金-铂、铂纳米形貌的SEM表征aHAuCl4,bHAuCl4/H2PtCl6=3/7,cHAuCl4/H2PtCl6=1/1,dHAuCl4/H2PtCl6=7/3,eH2PtCl63.3.4实验条件的优化3.3.4.1HAuCl4/H2PtCl6摩尔比例优化采用电致化学发光技术研究了摩尔比例不同时ECL信号强度变化，实验结果如图3-5A所示，当HAuCl4/H2PtCl6摩尔比为1:1时，可获得最大的ECL信号强度。因此，为了获得更高的分析灵敏度，选用摩尔比1:1为该体系的最佳摩尔比。3.3.4.2电沉积时间的优化电沉积纳米材料性质会受电沉积时间的影响，因此我们探讨了电沉积时间对ECL信号强度大小的影响。如图3-5B所示，在200-400s区间内，随着时间的延长，ECL光强度明显增大，当沉积时间超过400s后，ECL光强大小随时间影响变化不大，由此说明400s时，金铂纳米合金材料的沉积量达到饱和，选用400s为该体系的最佳电沉积时间。28 第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究图3-5实验条件的优化3.3.5EDS分析EDS可以用来分析纳米材料的化学元素组成。在该体系中EDS技术用于考察Au-PtNPs/F-MWCNTs纳米复合材料的元素组分，实验结果如图3-6所示，能谱图中出现了C、O、Au、Pt特征吸收峰，说明纳米复合材料的组成是羧基化多壁碳纳米管和金铂纳米合金材料（而非单金属纳米材料本身），可进一步说明金铂纳米合金材料的成功制备。7500AuAuPt600045003000I1500OPtPtnCAuAutAuenPtPtPtPtAus0ity(a0123456789101112.u.)KeV图3-6金铂合金-功能化多壁碳纳米管表面元素分析29 西南大学硕士学位论文3.3.6酶传感器对D-丙氨酸的特异性识别本实验研究了丙氨酸对映异构体在DAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCE修饰电极表面的ECL响应大小，如图3-7所示，D-或L-丙氨酸的ECL信号响应出现较大差异，且D-丙氨酸的信号响应明显优于L-丙氨酸，这是因为D-氨基酸氧化酶仅能立体选择性性催化氧化D-丙氨酸产生鲁米诺的共反应试剂过氧化氢，它可以极大地增强鲁米诺的发光性能，获得较强的ECL信号，而L-丙氨酸不能被催化分解，因此ECL信号响应较弱。1800015000D-Ala1200090006000L-Ala3000EC0Linte0.20.30.40.50.6nsitPotential/Vy/a.u图3-7丙氨酸对映异构体在电极表面的ECL信号响应曲线.3.3.7酶传感器对D-丙氨酸的ECL信号的线性响应在最优条件下，我们研究了该酶传感器的ECL信号响应与不同浓度的D-丙氨酸标准液之间的关系。如图3-8所示，在5.0×10−9-5.0×10−3mol·L-1范围内，该传感器的ECL强度随D-丙氨酸浓度的对数值变化呈现良好的线性关系，线性方程为I=19454.86+2205.50lgc（其中I表示ECL强度，c表示cD-Ala的浓度），相关系数R=0.9907，检出限为1.67×10−9mol·L-1。为了更好的展现该ECL生物传感器的良好的分析性能，我们将之于已发表的检测D-丙氨酸的电化学传感器和类似的ECL生物传感器的分析性能进行了对比研究，结果如表3-1和表3-2所示，可以看到我们构建的酶传感器具有更宽的线性响应范围和更低的检测限，因此，该传感器将有30 第3章基于碳纳米管-金铂纳米合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究望应用于D-丙氨酸的高灵敏性定量检测。1800015000I=19454.86+2205.50lgcR=0.99071200090001800015000600012000g9000600030003000aEEC0LCin0te0.20.30.40.50.6LnsPotential/Vitiy/na-9-8-7-6-5.u-4-3-2te.nlgc/mol·L-1sity/a.u.图3-8D-丙氨酸的标准曲线表1.基于D-氨酸氧化酶的电化学传感器及电致化学发光传感器性能对比线性范围检测限修饰电极检测方法参考文献.(molL−1)(molL−1)DAAO/Pin5-COOH/ZnSNPs/Au电化学1.0×10-6-2.0×10-31.0×10-6128electrodeDAAO/POD/PVI[Fe(CN)-6-4-65]/GCE电化学1.0×10-1.5×102.0×10158DAAO/c-MWCNT/CuNPs/PANI/电化学1.0×10-6-1.0×10-32.0×10-7159/AuelectrodeDAAOx/BSA/PB/Nafion/SPE电化学5.0×10-6-2.0×10-41.0×10-6160DAAO/Au-PtNPs/MWCNTs/GCE电致化学发光5.0×10-9-5.0×10-31.7×10-9本研究31 西南大学硕士学位论文表2基于鲁米诺电致化学发光传感器分析性能对比研究线性范围检测限修饰电极分析物参考文献(molL−1)(molL−1)CS-GOx/nanoAu-MWCNTs/GCE葡萄糖1.0×10-6-1.0×10-31.0×10-7161GOx/AuNPs/sol–gel/Auelectrode葡萄糖1.0×10-6-5.0×10-32.0×10-7162Nafion/GOx/nanoPd-MWCNTsGCE葡萄糖1.0×10-7-1.0×10-35.4×10-81631.0×10-8-1.0×10-5;Nafion/LOx/nanoZnO-MWCNTs/GCE乳酸2.0×10-71641.0×10-5-1.0×10-4ChOx/AuNPs/L-cys-rGO/GCE胆固醇3.3×10-6-1.0×10-31.1×10-6165ChOx/MWCNTsGO-Thi-Au/GCE胆固醇1.0×10-8-8.3×10-45.0×10-8166ChOX/TNTs/CHIT/GCE胆碱1.0×10-7-5.0×10-41.0×10-8167DAAO/Au-PtNPs/F-MWCNTs/GCED-丙氨酸5.0×10-9-5.0×10-31.7×10-9本研究3.3.8酶传感器的选择性选择性是评价传感器性能的一个重要指标，因此在最优实验条件下，将酶传感器置于含有相同浓度的一系列D-氨基酸的标准液中，并记录它们的ECL信号大小。如图3-9所示，该酶传感器能够对一系列的D-氨基酸具有明显不同ECL信号响应特性，而对D-丙氨酸的信号响应最好，可为D-氨基酸的高灵敏和特异性检测提供良好的发展平台。图3-9酶传感器的选择性32 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究3.3.9酶传感器的稳定性、重现性从实际应用的角度看，酶传感器的稳定性是极其重要的考察目标。因此，我们做了相应的稳定性考察实验，结果如图3-10所示，在不同D-丙氨酸浓度下，传感器都具有较好的稳定性，这是由于多壁碳纳米管和金铂纳米合金材料对酶的高效和稳定固载。为了进一步考察该酶传感器的重现性，取六支同样方法制备的DAAO/Au-PtNPs/MWCNTs/GCEs置于5.0×10−3mol·L-1D-丙氨酸（含1.0×10−3mol·L-1鲁米诺）中，并记录ECL信号大小，结果表明六支电极具有大小一致的信号响应，得到批内测定值的相对标准偏差（RSD）小于5.0%，说明该传感器具有较好的重现性。18000g15000f12000e9000d6000cb3000aECL0inte050100150200250300350400nsitTime/sy/a图3-10生物传感器的稳定性.ua.5.0.×10−9mol·L-1,b.5.0×10−8mol·L-1,c.5.0×10−7mol·L-1,d.5.0×10−6mol·L-1,e.5.0×10−4mol·L-1,f.5.0×10−4mol·L-1,g.5.0×10−3mol·L-13.4结论简言之，该体系借助功能化多壁碳纳米管、金铂纳米合金材料制备了新型D-氨基酸氧化酶生物传感器，检测原理是基于D-氨基酸氧化酶对D-氨基酸的立体选择性催化氧化，并产生鲁米诺的共反应试剂过氧化氢，可以极大地增强鲁米诺的ECL信号响应，而L-氨基酸不能被氧化产生过氧化氢，因而响应信号较小。同时，我们对纳米复合材料的制备过程进行了电化学性能及形貌特性考察，并对实验条33 西南大学硕士学位论文件进行了优化。实验结果表明，在最优实验条件下，与其它D-氨基酸相比，该传感器对D-丙氨酸具有更好的响应，且L-丙氨酸不会造成干扰，且具有如线性范围宽、成本低、稳定和重现性好等优点，我们期望该传感器可用于D-丙氨酸的高灵敏和特异性定量检测，为食品污染、生命科学等领域提供新思路。34 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究第4章基于金钯纳米合金、功能化石墨烯的电致化学发光L-谷氨酸传感器研究4.1前言氨基酸是构成蛋白质的基本单元，大多数具有手性（除甘氨酸外）。在人类日常生活中，需要通过食物或药物摄入一定的氨基酸以维持健康。氨基酸不同对映异构体的理化作用可能有所不同，例如L-谷氨酸是诊断心肌和肝脏疾病的重要标志物[168-169]，也是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。脑脊髓液中的L-谷氨酸含量超标将引发神经系统疾病，如中风、老年痴呆症、帕金森疾病等[170,171]。同时，它还与学习、记忆、神经系统发育、生物敏感性或神经突触可塑性等息息相关[1172,173]。此外，人体内L-谷氨酸含量水平与某些生理问题间密切相关，如攻击性行为、视觉任务学习、吗啡诱导的肌肉强直和逆行性遗忘症。然而，D-谷氨酸是否具有调节神经元的作用尚不明确[174]。因此，L-谷氨酸体外含量水平检测具有重要的研究价值。目前，已有多种方法可用于L-谷氨酸的含量检测，主要有色谱法、荧光法、分光光度计和毛细管电泳等。这些方法在L-谷氨酸的灵敏性检测方能具有独特的优势，但是这些方法却有无法克服的困难，如操作步骤复杂、仪器昂贵、耗时耗力等。而基于L-谷氨酸氧化酶的生物传感器可以很好的解决上述问题，如仪器简单、检测快速、成本低廉等，因此掀起了L-谷氨酸传感器的研究热潮[175,176]。L-谷氨酸氧化酶可以特异性催化氧化L-谷氨酸，并产生具有电活性的过氧化氢，同时也是经典电致化学发光发光探针鲁米诺的共反应试剂。酶催化反应过程阐述如下[177]：Glutamate+OGluOx2+H2O2-Oxoglutarate+NH3+H2O2。石墨烯（graphene）是由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格平面薄膜结构的二维材料，具有独特的物理、化学性质，如优良的导热率和导电率、高强度机械韧度和较大的比表面积等[178-180]。因此，它在纳米电子学、传感器、纳米复合材料和电池等领域具有巨大的应用潜力。为了充分利用石墨烯的优良性能，对石墨烯的改性的研究日益多样化，如利用π-π堆积作用可将氯化血红素（hemin）修饰到石墨烯表面，制得更高级的纳米复合材料[181,182]。该纳米复合材料具有良好的导电性及生物相容性，能够极大地增强鲁米诺-过氧化氢体系的电致化学发光信号[183,184]。贵金属纳米材料的表面有许多不饱和配位活性金属原子，可以与带有巯基或氨基的分子（如：蛋白质、酶）结合，并能很好地维持生物分子的生化活性，因此常被用于生物传感器中酶、蛋白质或其它材料的固载。此外，金属纳米材料还具35 西南大学硕士学位论文有较强的电致化学发光催化活性，可用于鲁米诺-过氧化氢体系的信号放大[185,186]。本研究工作中，我们借助氯化血红素功能化的还原氧化石墨烯纳米复合材料（H-RGO）、金钯纳米合金材料（Au-PdNPs）和L-谷氨酸氧化酶制备得到一种新型L-谷氨酸生物传感器，并研究了该传感器与D-或L-谷氨酸的相互作用。实验结果表面该传感器在L-谷氨酸的灵敏性检测方面具有优良的性能，如低电位激发、灵敏度高、线性范围宽、稳定和重现性好等。4.2实验部分4.2.1试剂与材料L-谷氨酸氧化酶（L-GluOx，1U·mg-1，固体），D-/L-谷氨酸（D-/L-Glu，98%），D-丙氨酸（L-Ala，98%）、L-丝氨酸（L-Ser，99%）、L-苯丙氨酸（L-Phe，98%）、D-赖氨酸（D-Lys，98%）购于Sigma公司（美国，St.Louis,MO）；四水合氯化金（HAuCl4•4H2O，99.99%），氯钯酸钾（99%）、L-精氨酸（L-Arg，98%）购买于阿拉丁试剂有限公司（中国，上海）。牛血清白蛋白（BSA，98%），氯化血红素（98%）、缬氨酸（L-Val，99%）、L-脯氨酸（L-Pro，99%）、L-色氨酸（L-Trp，99%）百灵威试剂有限公司（中国，北京）。氧化石墨烯（GO）购买于南京纳米先锋科技有限公司(中国，南京)；磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠（Na2HPO4）和氯化钾（KCl）购于北碚试剂厂（中国，重庆）。实验前制备0.1mol·L-1不同pH值磷酸缓冲液（PBS）。其余化学试剂均为分析纯，无需进一步纯化即可直接使用。所有实验用水均为二次蒸馏水，所有实验均在室温下进行（25±0.5°C）。4.2.2仪器所有电化学发光测试和电化学测试都是在MPI-E型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司、中科院长春应化所）和CHI604D型电化学工作站（上海辰华仪器公司）上进行，标准三电极体系中，饱和银/氯化银电极（Ag/AgCl）作为参比电极，铂丝电极作为对电极，玻碳修饰电极作为工作电极；扫描电子显微照片和X-射线能量散射谱（EDS）由扫描电子显微镜（S-4800，日本HitachiInstrument公司）测得。紫外光谱数据由UV-2450型分光光度计测得。4.2.3H-RGO纳米复合材料的制备氯化血红素（hemin）功能化的还原氧化石墨烯纳米复合材料的制备可参照文献[187]。具体制备过程简述如下：将10.0mL超声分散均匀的氧化石墨烯溶液（0.5mg·L-1）和10.0mL同浓度的氯化血红素水溶液均匀混合，并在剧烈搅拌下加入36 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究100.0µL浓氨水和20.0µL水合肼，并置于60°C的水浴条件下充分反应12小时，可得到分散均一的黑色混合液。离心，洗涤，收集产物，并重新分散于二次蒸馏水，得到H-RGO分散液。4.2.4修饰电极的制备首先，裸玻碳电极（GCE，Φ=4mm）分别用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉打磨抛光，依次在乙醇和二次蒸馏水中超声清洗5分钟，空气中自然晾干。在干净的GCE上滴涂6µL的H-RGO分散液，室温下自然晾干，得到修饰电极H-RGO/GCE。接下来，将得到的H-RGO/GCE置于含有2.5×10−3mol·L-1HAuCl4和2.5×10−3mol·L-1KPdCl4的0.1mol·L-1的KCL溶液中，施加–0.2V的恒电压电沉积[188]，得到Au-PdNPs/H-RGO/GCE修饰电极，取10µLL-谷氨酸氧化酶溶液（0.25U·mL-1，PBS7.4）滴涂到Au-PdNPs/H-RGO/GCE修饰电极表面，在4°C孵育过夜，得到L-GluOx/Au-PdNPs/H-RGO/GCE（酶传感器的构建过程如图4-1）。图4-1传感器制备过程示意图4.3结果与讨论4.3.2H-RGO的紫外表征和CV表征图4.2所展示的是氧化石墨烯（GO）、氯化血红素（hemin）和氯化血红素功能化的还原氧化石墨烯（H-RGO）的紫外特征吸收曲线。氧化石墨烯（曲线a）在37 西南大学硕士学位论文230nm处出现最大吸收峰，是由芳香环C=C键的π-π*跃迁引起，此外300nm处的肩峰则是由C=O键的n-π*跃迁引起[189]。氯化血红素（曲线b）在384nm处呈现最强吸收峰，可归因于索雷谱带，同时500-700nm之间的弱吸收峰则是Q吸收带引发。通过化学还原和π-π堆积作用，可以将氯化血红素修饰到石墨烯表面制备到H-RGO，紫外光谱技术可用于观察该制备过程[187,190]。如图4-2A曲线c所示，索雷谱带特征吸收峰从384nm红移到416nm，这是由于二者之间的π-π堆积作用[189,190]。以上实验数据说明，氯化血红素和还原氧化石墨烯之间存在较强的作用力，可以制备得到H-RGO。氯化血红素是一种良好的电子媒介体（Fe(III)/Fe(II)），可充当氧化还原探针。因此，为了进一步考察H-RGO的制备，我们对比研究了GCE、RGO/GCE和H-RGO/GCE修饰电极在0.1mol·L-1磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）中的循环伏安特性。如图4-2B所示，当没有hemin存在时，裸玻碳电极（曲线a）和还原氧化石墨烯（曲线b）无法观测到氧化还原峰出现。与此同时，H-RGO/GCE修饰电极（曲线c）呈现一对峰形对称的氧化还原峰，也是hemin典型的氧化还原峰。实验结果表明，借助热还原作用及分子间作用力，氯化血红素功能化的还原氧化石墨烯得以成功制备。1.290A1.038460cB2304160.826130b0.6Aa0/0.4IA-30cbs0.2ora-60ba0.0nbc-90e200300400500600700800-0.8-0.6-0.4-0.20.0Wavelength/nmE/V图4-2(A)氧化石墨烯（a），氯化血红素（b）和氯化血红素功能化还原氧化石墨烯（c）的紫外表征；（B）裸玻碳电极（a），还原氧化石墨烯（b）和氯化血红素功能化还原氧化石墨烯（c）的循环伏安特性曲线。38 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究4.3.3不同修饰电极的电化学性能测试采用循环伏安法研究了电极逐级修饰过程中的电化学特性，电极表征在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)4-/3-6]（pH8.0）溶液中进行。电位扫描速度为100mV·s-1，扫描范围为-0.6~0.2V（vs.Ag/AgCl）。如图4-3A所示，与裸电极相比（曲线a），H-RGO/GCE修饰电极（曲线b）峰电流下降，峰电位差变大，这是因为氯化血红素附着在还原石墨烯表面能够阻碍电子传导速率。当在电极表面电沉积上金钯合金纳米颗粒后（曲线c），峰电流明显增加，呈现较好的氧化还原峰，说明金-钯合金能够促进电极表面的电子传递。当Au-PdNPs/H-RGO/GCE修饰电极表面覆盖上L-谷氨酸氧化酶后（曲线d），峰电流急剧下降，说明金钯纳米合金可以固载较多酶，而酶强烈阻碍电子传导的性质使得电流明显下降。交流阻抗技术也应用于研究电极逐级修饰过程中阻抗值的变化，测试过程是在5.0×10-3mol·L-1[Fe(CN)4-/3-6]（pH7.4）溶液中进行。图4-3B展示的是EIS研究整个过程的实验结果，Ret为电荷转移电阻，也是实验中重点考察参数。交流阻抗数值采用ZSimpWin软件进行等效模拟[157]。如图所示，裸玻碳电极的阻抗值约为143.2Ω，而当电极表面修饰上氯化血红素功能化的石墨烯后，Ret值上升到597Ω，说明该复合材料阻碍电子传递。随后，当电极表面电沉积上金钯纳米合金材料后，电极转移电阻值急剧下降到26.0Ω，说明金钯纳米合金材料具有优良的电化学催化性能，能够极大地增强电子的传导速率。酶是一种阻碍电子传递的蛋白质，因此当谷氨酸氧化酶滴涂到Au-PdNPs/H-RGO/GCE修饰电极表面后，Ret值增加到1146.3Ω。300c2000BbA200ab1500100ddA01000/I/o-100Zh-''m500ca-2000-300-0.20.00.20.40.605001000150020002500E/VZ'/ohm图4-3不同修饰电极的CV(A)和EIS(B)图a.裸GCE,b.H-RGO/GCE,c.Au-PdNPs/H-RGO/GCE,dDAAO/Au-PdNPs/H-RGO/GCE39 西南大学硕士学位论文4.3.4不同材料的SEM表征和EDS分析实验中采用扫描隧道电子显微镜（SEM）考察不同纳米材料的表面形貌特征。测试结果如图4-4A所示，氯化血红素功能化的石墨烯呈现典型的褶皱状，而纳米金钯纳米合金材料均匀地附着在褶皱的石墨烯表面（图4-4B），可说明氯化血红素功能化的石墨烯可充当贵金属金钯纳米合金材料的固载基质。采用EDS技术分析研究了电沉积法制备的金钯纳米合金材料的元素分布，并以图4-4B为采样区间，进行面扫，实验结果如4-4C和4-4D所示，可以看到金、钯元素分布在相似的位置，说明我们的纳米合金材料是制备成功的。ABCAuDPd图4-4纳米材料的SEM形貌表征和EDS表征4.3.5酶传感器对L-谷氨酸的特异性检测识别本实验研究了谷氨酸对映异构体在L-GluOx/Au-PdNPs/H-RGO/GCE表面的电致化学发光ECL信号响应，如图4-5所示，D-或L-谷氨酸的ECL信号响应出现较大差异，而且L-谷氨酸的信号响应明显高于D-谷氨酸，当检测底液中不含有谷氨酸时，ECL信号响应较小。这是因为L-谷基酸氧化酶仅能立体选择性地催化氧化40 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究L-谷氨酸产生鲁米诺的共反应试剂（H2O2），共反应试剂可以极大地增强发光体鲁米诺的发光信号，从而获得很强的ECL信号，而D-谷氨酸不能被催化，因此其ECL信号较小。谷氨酸是一种酸性氨基酸（等电点3.22），因此加入有D-谷氨酸的底液与空白底液相比，pH值偏小，而鲁米诺的电致化学发光信号在碱性条件更强，这就能很好的解释空白底液的ECL信号略强于D-谷氨酸。100008000c600040002000EaCbL0inte024681012nsitTime/sy图/a4-5谷氨酸对映异构体在电极表面的ECL信号响应曲线.u.a空白,bD-谷氨酸，cL-谷氨酸4.3.6酶传感器对L-谷氨酸的ECL信号的线性响应10000I=13081.69+66.27lgcR=0.9957800060001000040008000-3-160005×10molL4000-7-11×10molL2000E2000ECLCi0nteLn024681012sitiyTime/s/n0a.ute-7-6-5-.4-3-2n-1slg(c/mol·L)ity/a图4-6传感器对L-谷氨酸的标准曲线.u.41 西南大学硕士学位论文在本实验中，我们研究了该生物传感器的ECL信号响应与不同浓度的L-谷氨酸标准液之间的关系，如图4-6所示，在1.0×10−7-5.0×10−3mol·L-1范围内，该生物传感器的ECL信号大小随L-谷氨酸浓度的对数值变化呈现良好的线性关系。其线性方程为I=13081.69+66.27lgc（其中I表示ECL强度，c表示cL-Glu的浓度），相关系数R=0.9957，检出限为3.3×10−8mol·L-1。基于上述分析结果可知该传感器性能良好，如线性检测范围宽，检测限低等优点，可以应用于L-谷氨酸的特异性定量检测。4.3.7选择性为了考察其它氨基酸对该传感器检测L-谷氨酸的干扰性，我们将该生物传感器置于含有一系列含有相同浓度的L-氨基酸的测试底液（含1.0×10−4mol·L-1鲁米诺）中，在相同实验条件下测试它们的ECL信号响应大小，实验结果如图4-7所示，该生物传感器仅对L-谷氨酸具有较好的信号响应，而其它氨基酸的响应信号较小，不会对L-谷氨酸的信号响应造成干扰，证明该传感器具有亮好选择性，有望实现对L-谷氨酸的高灵敏、高选择性检测。图4-7传感器的选择性4.3.8酶传感器的稳定性、重现性生物传感器的稳定性是实现其实际应用的重要参考指标，因此我们进行了相关的稳定性考察实验，结果如图4-8所示。该传感器在每一个实验浓度下都能具有42 第3章基于碳纳米管-金铂合金-D-氨基酸氧化酶复合材料的电致化学发光传感器研究较好的稳定性，可是氯化血红素功能化的还原氧化石墨烯和金钯纳米合金材料颗粒的协同作用，使得L-谷氨酸氧化酶在电极表面更高效、稳定地固载。为了进一步考察该酶传感器的重现性，我们将六支同样制备的L-GluOx/Au-PdNPs/H-RGO/GCE置于1.0×10−3mol·L-1L-谷氨酸（含1.0×10−4mol·L-1鲁米诺）中记录ECL信号大小。结果表明，六支电极具有相似的信号响应，且相对标准偏差（RSD）小于5.0%，证明该传感器具有较好的重现性。g10000fe8000d6000c4000b2000aECL0intenTime/ssity/图4-8传感器的稳定性aa.1.0×10−7mol·.uL-1,b.1.0×10−6mol·L-1,c.1.0×10−5mol·L-1,d.1.0×10−4mol·L-1,e.1.0×10−3.mol·L-1,f.3.0×10−3mol·L-1,g.5.0×10−3mol·L-14.4结论本文成功构建了一种新型L-谷氨酸电致化学发光生物传感器，并用于研究它与L-或D-谷氨酸的相互作用。在该研究中，首先成功制备了氯化血红素功能化的还原氧化石墨烯，并通过恒电位沉积方法制备金钯纳米合金材料，两种纳米复合材料均可以放大鲁米诺的ECL信号，同时也可以充当良好的固载酶基质。同时，采用SEM技术、EDS光谱技术以及紫外光谱技术对合成的纳米材料形貌及光谱性能进行了考察，这些分析手段很好佐证了纳米复合材料的成功制备。实验结果表明，该传感器对L-谷氨酸具有很好的ECL信号响应，具有线性范围宽、检测限低、选择性好、稳定性好等优点。该传感器可用对L-谷氨酸含量水平的高灵敏性定量检测。43 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致谢致谢岁月如梭，光阴似箭，三年的研究生的学习生涯即将画上句点。回首这三年的求学生活，有欢声笑语，亦有悲愁垂涕，但都是我人生中珍贵的回忆，也使我受益匪浅。值此论文完成之际，我谨向所有关心、爱护和帮助过我的人致以最诚挚的谢意和最衷心的祝福！首先，要特别感谢我的导师傅英姿教授。感谢傅老师让我有机会进入401这个温暖的大家庭。三年来，感谢您对我科研上以及生活中的悉心指导和热情关怀，让我的异地求学充满温暖。在科研上，感谢您对我的耐心指导和精心培养，也是您的温声鼓励让我遇到困难时，能够有勇气前行。尤其是在我论文修稿时，是您陪我细细研读专家建议，并指导我一一作出合理答复。在生活中，十分感谢傅老师对我的谆谆教诲和无微不至的关怀，让我学到了很多做人的道理。感谢西南大学化学化工学院各位领导和老师的悉心栽培，也特别感谢辅导员田丰老师对我的帮助。同时，感谢袁若教授和柴雅琴教授课题小组在科研工作中提供的无私帮助和指导。感谢师姐黄意涵、张清、郭丽菊、陈亚、郭冬梅、陈翠、朱姝在科研上的细心引导和生活中的无私帮助，感谢同级的许娟娟、轩春芝，师妹夏巧、林霞、马骄以及师弟杨成成，对我实验以及论文完成的热心帮助，感谢缘分让我们相遇、相知、相惜，也感谢你们每天的陪伴让我在401度过了美好的研究生学习生活，这段美好的回忆将是我的幸福烙印，伴随我一生。感谢我的好友的关心和帮助，是你们的鼓励让我有勇气克服学习和生活中的各种困难，勇往直前，使我度过充实而又温馨的三年求学时光。同时也深深感谢我的父母及家人给予我的莫大理解、支持和鼓励，感谢你们在我身后一直无怨无悔的付出，祝愿你们健康平安。最后，向在百忙之中审阅我的论文及参加论文答辩会的老师和同学表示衷心的感谢！王庆红2016年4月于西南大学65
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