鸭圆环病毒orf3基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备与应用

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3、四川农业大学硕±学位论文论文独创性巧明本人郑重声明；所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进斤研究工作所取得＇的成果。尽我所知，除了文中特别加标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它一教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我同工作的同志对本研巧所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名；年谷月八＞日关于论文使用授权的黄明、本人完全了解四川农业大学有关保留使用学位论文的规定，即；学校有权保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅

4、，可Ｗ采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可１＾＞１用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：Ｗ年Ｙ月八＞日＾口导师签名：公年衫月户日四川农业大学硕±学位论文本论文的创新性工作１．鸭圆环病奉ＯＲＴ３蛋白的表达及纯化；将ＰＣ民特异性扩增的０ＲＦ３片段克隆到原核表－－－－达载体上，成功构建了ｐＥＴ３２ａＯＲＦ３和ｐＧＥＸ６ｐＯＲＦ３重组质粒。该载体转化Ｒｏｓｅｔａ（ＤＥ３）后用ＩＰＴＧ成功诱导表达了３０ＫＤ和３５ＫＤ的０ＲＦ３融合蛋白，与一致－－－－预期大小，对ｐＥＴ３２ａＯＲＦ

5、３的最佳ＩＰＴＧ诱导浓度为０．８ｍＭ，而对ｐＧＥＸ６ｐ，这两种融合蛋白都主要是Ｗ包涵体的形式存在ＯＲＦ３是０．２ｍＭ。应用Ｎ产柱层析技－３２ａ－ＯＲＦ３融合蛋白－术纯化带有曲Ｓ标签的ｐＥＴ：应用包涵体洗漆和ＳＤＳＰＡＧＥ胶切－－ＧＥＸ６ＯＲＦ３重组蛋白，均得到了高纯度的目的蛋白胶回收相结合的技术纯化ｐｐ，而且其抗原活性均保持良好。－２ＥＴ－３２ａＯＲＦ３融合蛋白．鸭圆环病毒ＯＲＦ３蛋白的单克隆抗体的制备将纯化的ｐ免疫－－小鼠后，用ＳＰ２／０骨髓瘤细胞与其酷细胞按１：４的比例誕合６ＯＲＦ３纯。再利用ｐＧＥＸｐ化蛋白对融合细胞进行筛选，获得了４株抗ＤｕＣＶＯＲＦ３

6、蛋白抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定：这４株杂交瘤细胞分泌的单抗均属于ＩｇＭ亚型，且特异性强，能稳定地分泌－抗体，用其制备的腹水型抗体，效价为１：２５６００１：１０２４００。３．鸭圆环病毒ＯＲＦ３蛋白间接竞争Ｅ：ＬＩＳＡ方法的建立：利用ＤｕＣＶＯＲＦ３的重组蛋白和其腹水型的单克隆抗体，通过抗原包被浓度、血清和腹水的稀释度Ｗ及竞争作用时间的优化，建立了间接竞争性ＥＬＩＳＡ检测方法。该方法便捷、灵敏度高，能够特异性的一ｕＣＶ检测ＤｕＣＶＯＲＦ３的存化为进步研究ＤＯＲＦ３的功能、抗原性和致病机制提供新的平台。Ｉ四川农业大学硕±学位论文中文摘要鸭圆环病

7、毒被巧类于圆环病毒科圆环病毒属，该病毒０ＲＦ３所编码的蛋白功能目前尚一未阐释，给进，。为了制备针对该蛋白的单克隆抗体步探索该蛋白功能提供素材论文对本实验室分离鉴定的〇此￥饼？巧基因开展了［＾１下实验：〇１记￥０化朽基因的生物信息学分析、０化阿基因的克隆表达及纯化、单克隆抗体的制备、间接竞争ＥＬＩＳＡ方法的建立和应用，结果如下：１．ＤｕＣＶ０化巧的生物信息学分析９８８ｂ，＜９化巧．８