免疫荧光技术简介

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1、免疫荧光技术简介技术支持

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3、时间：2010-2-22PriCells-免疫荧光技术（Immunofluorescencetechnique）1941年，Coons等于首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。一、荧光免疫技术的概念：免疫荧光技术（I

4、mmunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。将抗原或抗体用荧光素进行标记，标记的抗原或标记的抗体与相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术称为免疫荧光素技术。免疫荧光细胞化学分直接法、夹心法、间接法和补体法。二、荧光免疫技术分类：（1）荧光抗体显微镜技术：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。（2）免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法三、荧光的产生：物质吸收外界能量而进

5、入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素。由光激发所引起的荧光，为光致荧光；由化学反应所引起的荧光，为化学荧光。四、荧光素的荧光特性：（1）停止供能，荧光现象随即终止（2）对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<发射光波长（3）荧光效率：荧光效率=发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数（4）荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱五、常见荧光素：（1）异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)：FITC纯品为黄色

6、或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。（2）四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)：RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570n

7、m，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。（3）四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)：TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。（4）镧系：镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光

8、，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。（5）藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。（6）多甲藻叶绿素蛋白（p

9、eridininchlorophyllprotein，PerCP）：PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，最大激发波长的峰值在490nm附近，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。（7）碘化丙啶（propidiumiodide，PI）：可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm波长激发下，PI的发射

10、光谱为610-620nm。FL2探测器检测PI。常见荧光素的特性：（1）FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。（2）RB200：橘红色粉末,吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光。（3）TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光。（4）镧系：Eu、Tb（5）PE：吸收光490～560nm，发射光595nm，红色荧光。（6）其它