免疫荧光技术课件

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1、免疫荧光技术Coons和Coworkers（1941）通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立了该项技术，人们在Coons等的基础上发展完善了这一技术。尤其是近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使这门技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。第一节免疫荧光技术的原理一、免疫荧光技术的基本原理免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗

2、体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法以及与亲和化学物质标记荧光素的方法，例如：SPA荧光素标记物，生物

3、素与卵白素、植物血凝素荧光素标记物等。二、荧光产生的原理分子都含有电子，电子在不断地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态（即能级）中，电子遵守一定的规则，可以从一个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）。在一定的条件下，电子可吸收能量（如光能，热能，电能，机械能等）跃迁到较高能量级（即激发态），这个过程叫激发。处于激发态的电子是不稳定的，它总是要跃迁回到基态，并将多余的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐射方式跃迁

4、时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光叫荧光，其寿命较短。1838年Brewster首先描述了荧光现象，但荧光一词，是由Stokesl852年提出的。第二节荧光素一、荧光色素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，荧光色素必须具备吸收激发光的光能并发射荧光，具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。吸收的光能转变为荧光的百分数称为“荧光效率”。荧光效率与发射荧光量子的数值成正比。荧光效率（%）=（发射荧光

5、的光量子数）×100（吸收光的光量子数）荧光强度（即发射荧光的光量子数）和激发光（吸收的光量子数）的强度有关，激发光越强，荧光也越强。荧光素可以发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧光。光的强弱也与溶解荧光素的pH值、浓度、染色时间和温度等条件有关。荧光素的种类很多，但用于标记抗体的荧光素，不同于一般荧光色素，它必须具备以下条件：①应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易理解，而未结合的色素及其降解产物容易排除。②荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。③结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合应无毒性，附加抗原性小。④与蛋白质结合的方法简便而快速

6、，结合物在一般条件下稳定。⑤荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。二、可用于标记抗体的荧光素用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到目前为止有以下几种。1.异硫氰酸荧光黄（fluorescienisothiocyanate，FITC）纯品为黄色粉末，有两种异构体，易溶于水和乙醇等溶剂，在溶解状态下呈黄绿色荧光。性质稳定，低温干燥下可保存多年，室温下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型荧光效率更高，与蛋白质结

7、合更稳定。其结构式，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。2.四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamineisothcyanate，TRITC)是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明(Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿