慢病毒介导的LXRs过表达对高糖诱导H9C2细胞炎症反应的作用及机制研究

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌大堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：f。q乃么签字日期：钞9年二月多日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅

2、。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)、，学位论文作者签名(手写)：f乱∥纪导师签名(手写)：诜乃幺。{Ilj签字日期：加一年6月b日签字日期：伽，>年易月b日摘要目的：1．构建肝X受体(LXRs)过表达的慢病毒载体，进一

3、步感染H9C2细胞。2．观察过表达LXRs对高糖诱导的H9C2细胞炎症反应的作用。3．探讨过表达LXRs抑制H9C2细胞炎症反应的机制。方法：1．体外低糖正常培养H9C2细胞，再分别运用高糖和慢病毒进行干预。2．运用酶切法从含目的基因的质粒中获取Nrlh2和Nrlh3对应的基因片段，克隆到含绿色荧光蛋白GFP基因的GV287慢病毒载体中，产生重组慢病毒质粒：GV287．Nrlh2和GV287．Nrlh3。测序鉴定后与pHelperl．0、pHelper2．0共同转染293T细胞，最后获得携带Nrlh2和Nrlh3基因的重组慢病毒。3．将

4、构建的慢病毒感染H9C2细胞，感染后1-4天连续用荧光显微镜观察荧光表达情况，确定合适的感染复数(MOI)。4．实验分为五组：@Control组：正常对照组，用低糖培养基培养H9C2细胞；@Highglucose组：阳性对照组，用含33mmol／L葡萄糖的培养基培养H9C2细胞；@LXRa组：感染GV287-Nrlh3慢病毒组；@LXR[3组：感染GV287．Nrlh2慢病毒组；@GFP组：感染空载体慢病毒组。5．慢病毒感染72h后，用CCK．8检测各组H9C2细胞的增殖抑制率；同时应用qRT-PCR法分别检测LXRa、LXRl3和TN

5、F一0【、MCP．1、IL．6mRNA的表达；Westernblot和免疫荧光检测NF．vd3磷酸化蛋白的表达。结果：1．H9C2细胞从大鼠胚胎心脏组织的克隆细胞株亚克隆得到，在10％FBS低糖培养基培养下分裂快，贴壁后呈梭形生长。2．成功构建LXRs过表达的慢病毒载体，测序证实基因序列正确，包装产生的病毒滴度为2×108TU／ml。3．LXRs过表达慢病毒感染H9C2细胞，当MOI值为40时，24h后镜下可见较弱的绿色荧光，72h后荧光表达最强，加入终浓度为8I．tg／ml的polybrene协同增加感染效率。摘要4．qRT-PCR检

6、测LXRa和LXRl3mRNA表达结果：与Control组相比，LXRa组和LXR[3组mRNA表达水平明显上调俨0．05)。6．qRT-PCR检测TNF．0【、MCP．1、I

7、L．6mRNA表达结果：与Control组相比，Highglucose组TNF-0【、MCP一1、IL．6mRNA的表达明显上调(尸

8、约见40％和68％的胞核表达红色荧光。8．Westemblot检测NF．r,B磷酸化蛋白的表达结果：与Control组相比，Highglucose组蛋白表达水平明显上调(P<0．01)；而LXRa和LXRl