ANNEXINA2单体(P36)的表达、纯化及其单克隆抗体制备

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1、上海交通大学硕士学位论文AnnexinA2单体（p36）的表达、纯化及其单克隆抗体制备姓名：陆秋涯申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：陆佩华;黄立东20080513上海交通大学医学院05级硕士研究生学位论文上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海交通大学学位论文版权

2、使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日中文摘要上海交通大学医学院05级硕士研究生学位论文中文摘要AnnexinA2单体（p36）的表达、纯化、及其单克隆抗体制备目的：Annexins是一类钙依赖

3、性膜磷脂结合蛋白。AnnexinA2是Annexins家族中的一个重要成员，存在于细胞膜、胞质和胞外。AnnexinA2蛋白在细胞膜构架的形成、膜聚合、内吞和胞吐中均扮演重要角色。AnnexinA2还参与某些病理过程，与心血管疾病、血液病、肿瘤等多种疾病相关。本室通过脊髓损伤动物模型、microarray、体外神经元培养等技术发现：AnnexinA2在脊髓损伤后表达增高，AnnexinA2蛋白对神经损伤有明显保护作用，提示AnnexinA2有望成为神经损伤保护性药物。本研究在原有工作基础上，表达纯化AnnexinA2的单体――p36，并将纯化后的p36蛋白免疫小鼠，运

4、用杂交瘤技术获得抗p36单克隆抗体，以期为进一步研究AnnexinA2的体内外功能，以及开发相应的神经保护性药物奠定良好基础。方法：1）抽提大鼠来源的总RNA,RT-PCR扩增p36基因的全长序列，通过TA克隆接入pGEM-T质粒，蓝白板筛选后进行测序鉴定。2）酶切获得p36基因全长序列，并将其接入pET-28a(+)表达质粒中，构建成pET-28a－p36表达质粒，然后转化至BL21大肠杆菌，筛选、鉴定后，测序验证。3）采用IPTG诱导表达p36融合蛋白，利用融合蛋白N端存在的6个组氨酸标签，在变性条件下，通过Ni-NTA柱纯化p36蛋白。4）将纯化的p36蛋白与佐

5、剂充分乳化后免疫Balb/c小鼠，等小鼠产生相应抗体后进行杂交瘤融合，并通过筛选获得分泌抗p36单抗的特异性细胞株。5）将筛选出的细胞株注入Balb/c小鼠腹腔，等产生腹水后收集腹水，并进行抗体的纯化和鉴定。结果：1）克隆出大鼠p36全长基因，成功构建pET-28a-p36表达质粒,在BL21细菌中可成功诱导表达出p36融合蛋白。2）获得了纯化的p36融合蛋白。3）2中文摘要上海交通大学医学院05级硕士研究生学位论文获得了抗大鼠p36特异性单克隆抗体,经鉴定所得单抗可以和p36蛋白特异结合。结论：采用IPTG诱导表达的p36蛋白经SDS溶解蛋白沉淀制成的蛋白溶液具有良

6、好的免疫原性；运用杂交瘤技术获得了抗AnnexinA2单体p36的特异性单克隆抗体。关键词：AnnexinA2，p36，基因克隆和表达，单克隆抗体3英文摘要上海交通大学医学院05级硕士研究生学位论文英文摘要Expression,PurificationandSpecificMonoclonalAntibodiesPreparationofAnnexinA2Monomer(p36)AbstractObjective：Annexinsisakindofcalcium-dependent,membranephospholipidbindingproteins.Annexin

7、A2belongstothefamilyofAnnexins,whichexistsaseitheramembrane-associated,cytosolicorsolubleforminserum.AnnexinA2canactasamembranescaffoldprotein,involvedinmembraneorganization,membranefusion,endocytosisandexocytosis.Itisalsoinvolvedinsomepathologyprocessesandassociatedwithcardiov