annexina2抗体制备及其应用的实验研究

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1、分类号R392密级公开UDC硕士学位论文AnnexinA2抗体制备及其应用的实验研究学位申请人：聂纪芹学科专业：免疫学指导教师：刘朝奇教授二○一三年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineAnnexinA2antibodypreparationanditsapplicationinvitroGraduateStudent:NieJiqinMajor:ImmunologySupervisor:LiuChaoqiChinaThreeGorgesUnive

2、rsityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2013三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知

3、识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：为了研究人源膜联蛋白A2（AnnexinA2）在肿瘤发生发展中的作用，探讨annexinA2作为肿瘤分子靶点在肿瘤诊断及治疗中的应用，我们制备了其多克隆及单克隆抗体并进行了相关研究。方法：（1）用PCR克隆人的AnnexinA2的基因编码区，将其克隆入原核表达载体p

4、ET28a(+)，构建原核表达质粒pET28a(+)/AnnexinA2.(2)将构建的原核表达质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，用IPTG诱导目的基因的表达，通过超声裂解和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。表达的蛋白产物利用切胶回收的方法纯化，SDS-PAGE检测纯化情况，WesternBlot鉴定重组蛋白。(3)将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫兔子，耳缘静脉取血测定兔血清的效价，效价达到300000以上，动脉插管取血，收获的兔血清既为多克隆抗体。用间接ELISA方法测定抗体的效价，用Westernblot检测抗体的特异性，用细胞免疫荧光及FCM法检测细胞的定位。（4

5、）将纯化并透析、浓缩的重组蛋白免疫Balb/C小鼠，取效价最高的小鼠作为待融合小鼠；分离该小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，通过HAT选择性培养基培养，间接ELISA法筛选，用有限稀释法单克隆化，获得稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。将阳性单克隆细胞腹腔注射至小鼠腹腔，收获腹水离心后的腹水上清作为单克隆抗体。用间接ELISA检测抗体的效价，WesternBlot和免疫共沉淀检测抗体的特异性。（5）将制备的抗体应用于WesternBlot、细胞免疫荧光(CIF)和流式细胞术（FCM），检测真核细胞中目的蛋白的本底表达情况。（6）用外源的annexinA2单克隆抗体处理HepG2细胞，

6、用MTT法检测外源性抗体对细胞生长增值的影响；FCM检测细胞周期；RT-PCR和real-PCR检测细胞周期的相关基因；westernblot检测细胞周期相关基因中CDK6的表达情况；用划线法及transwell检测外源抗体对HepG2细胞的侵袭及迁移的影响结果：（1）经酶切和DNA测序鉴定，pET28a(+)/AnnexinA2原核表达质粒的构建是正确的。（2）原核表达质粒转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，1.0mMIPTG可诱导AnnexinA2重组蛋白的表达，表达的重组蛋白以包涵体的形式存在。运用切胶回收的方法纯化重组蛋白，SDS-PAGE分析其纯度均在80%以上，West

7、ernBlot（WB）鉴定显示重组蛋白各自兼有6×His的标签。（3）将纯化的蛋白免疫日本大耳白兔后，制备了特异的高滴度的多克隆抗体(ELISA滴度达1：640000)。Westernblot（WB）检测抗体的具有较好的特异性。CIF和FCM结果显示抗血清与肿瘤细胞表达的annexinA2有高度特异的结合活性。(4)将纯化的重组蛋白作为抗原免疫Balb/C小鼠后，经融合、筛选和克隆化，获得了四株阳性单克隆细胞株，并制备了