牛卵母细胞冷冻保存的研究

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1、西南农业大学硕士学位论文牛卵母细胞冷冻保存的研究姓名：包华琼申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：李跃民;王新庄2003.5.1牛抻母事I麓玲蜡-球矗蟾携览搐毒摘要搴实验探讨了冷冻保护荆、冷冻方法、郛母缨麓发蠢除羧、冻藩{：樊簸褒方法等鬻素对牛卵母细胞冷冻效果的影响，目的在于筛选适合超低渝冷冻保存牛卵母细胞的冷冻程序。遴过这一途径可望建立卵磷缯魏矛孛子霹，并为体乡}受精、努核移檬秘体缨照克隧研究与应用提供实验材料。研究结果如下：f(1)冷冻保护刹对牛卵母细胞毒性实嫩明：四釉冷冻保护剂：二甲基驻砜l(DM

2、SO)、丙二醇(PROH)、L--醇(EG)、曹涵(G己)在室添(250C)和培养湓度(39℃)条件下与牛GV期卵母细胞作用3rain，脱保护荆后进行体外成熟培养。表明：匿耱冷冻绦护裁在低浓疫室瀑(25℃)条磐下鼹牛GV潮雾霉缨德毒瞧弱，翟隧浓爱毯加毒性增强：39℃时毒性明显增加，其中EG毒性最弱。四种冷冻保护剂的毒性由强至弱是：GL>PROH>DMSO>EG。分别添如t．5mol／L冷冻保护剂(DMSO、PROH、EG、GL)程序化冷冻牛GV期卵母蹦胞时，EG和PROH对牛GV期卵母纲胞的保护眈GL、DMS

3、O效果要好～些。(2)采恁稷黟纯冷冻法、爨管玻璃纯浚(Straw)、费款式越警法(OPS)、毛缨蔽管法(GMP)冷冻牛GV期卵僻细胞。f解冻缀体外成熟、体外受精后观察2·细胞卵裂率～表明：程序毒乏冷冻釉Straw玻璃纯冷冻的卵裂率分别为3．33％和8。33％，二者差异不漫著(p>O．05)：OPS冷冻和GMP冷冻卵裂率分别为36．84％年n36．67％，二者差异不擞著(P>O．05)，但OPS冷冻和GMP冷冻与程序化冷冻、Straw玻璃化冷冻的卵裂率相比差异投黧薯(P<0。01)。结栗表裙：玻璃纯冷冻效栗优于

4、程露讫冷冻，GMP帮OPS饶予Straw玻璃化冷冻，GMP方法冷冻效果与OPS方法相近。，j“(3)采趸GMP法冷冻GV麓、体辨壤粪611、18h、22h各发育除袋麴劈母缨骢，《解冻后荐培养24h、18h、6h和2h，经体外受精分析卵袋率。冷冻后GV期卵母细胞的卵裂率为36．67％，培养6h和18h的卵裂率分别为40．98％和41．27％，三者之间无驻著羞努(P>0．05)，餐与瑶养22h辩蹲缩臆(52．38％)帮对照(68．镗％)差器檄显著(P固．01)。丰聱毒拇蘸夸壕鼙蓐柏碍竞莓羹体外成熟(1VM)卵母细

5、腿冷冻后卵裂率为52+38％，与对照(68．42％)差舆不显蔫(P>0．05)。冷冻不同发育阶段的牛卵母细胞的结果表明：体外成熟培养22h的卵母细胞冷冻效采好予GV期、培养6h、18h的努母缁艟，越接近成熬的卵母缁胞冷冻效采越(4)在卵母细胞玻璃化之前，分别采用1％EG、3％EG、6％EG、10％EG、I／2VS溶液颟处理l～t5min，跑较玻璃纯冷冻后卵母缭脆的幸奉外成熟率和郛裂率。精采表明袋翅3％豹EG稀溶滚预处理玻璃他翦牛辨母细胞可分别获得较藏的卵裂率36．96％。研究表明，采用GMP玻璃化冷冻法来保存

6、牛GV期卵母细胞是可行的。2毛细玻管法(GMP)__—一⋯1。—一牛卵母细胞玲壕锥矗柏槲竟AbstractStudiesOnCryo—preservationofBovineOocytesBaoHuaqiong(CollegeofAnimalandVeterinarySciences，SouthwestAgricuRureUniversitFChongqing400716)AbstractTheobjectiveofthisstudyistoprovideaneffectivemethodtocryopres

7、ervebovineGVoocytesforresearchandpracticeofgametebank，invitrofertilization，nucleartransferandcellcloning。Thestudycomparedtheeffectsofcryoprcservationreagent，freezingmethod，thedevelopmentalstagesofoocytesandequilibrationmethodinbovine。Theresultsasfollows：Stu

8、diesoncryoprotectantstoxicityforbovineooeytes．BovineGVoocytesweretreatedwithfour1．5—7．2mol／Lcryoprotectants(DMSO、PROH、EG、GL)at25"Cand39"C，thendilutedcryopmtectarttsandcomparedtheratioofthematurationinv