《ELISPOT方法》PPT课件

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1、一、ELISPOT检测细胞因子实验技术ELISPOT检测方法特点通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况在分泌细胞原处捕获该细胞分泌的细胞因子斑点的生成属于一种显色反应：SPOT=细胞印迹斑点可持久保存并进行计数分析可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例有效、快速、灵敏度高使用高吸附性的专用ELISPOT培养板细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍易操作样本量大的情况下实验结果可用计算机图

2、象分析系统进行快速、客观的分析106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞，经下列方法检测：ELISPOT细胞内细胞因子染色（FACS）ELISAX坐标：106APC中实际IFN-γ+T细胞数量Y坐标：各检测方法的检测结果ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较CoatingAb包被培养孔并经BSA阻断根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液孵育基本原理活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与CoatingAb结合洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应加入酶底

3、物显色形成斑点（SPOT）B细胞杂交瘤的筛选化合物和药物免疫学反应的检测优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性靶向疫苗的质控自身免疫疾病的诊断和预后分析自身免疫疾病免疫治疗的监控过敏性疾病的脱敏治疗的监测器官移植中排斥反应的预测微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析结核病的诊断ELISPOT方法主要用途P=0.0213DistributionofMHCmismatchedrenaltransplantpatientsperfrequencyofIFN-gammaproducingallopetidereactiveTCellsNaj

4、afianN,SalamaA,IlligensBW,et.alBRIGHAMANDWOMEN’SHOSPITALCHILDREN’SHOSPITALHARVARDMEDICALSCHOOLBOSTON,MAMinor-mismatchedAllograftMajor-mismatchedAllograft0250500750SpotsIFN-gammaproducingCellsinminorvs.major-mismatchedWTAllograftRecipientsonDay14PubMed搜索关键词immunospo

5、t或ELISPOT或ELISA-Spot所得历年文献数目猴ELISPOT细胞因子检测流程示意图CoatingAb包被培养板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔加入1%BSA阻断按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育5-24小时40C过夜370C孵育1小时取外周血单核细胞或脾淋巴细胞根据实验要求，培养液中加入所需刺激物，预先将所检测细胞孵育24-42小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞或者去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔，培养板置冰上10分钟加入生物素标记的detectorAb加

6、入酶标抗生物素抗体(GABA)40C暗处混合显色剂I和II,加入显色剂I/II,暗处室温孵育20-30分钟PBST洗板10次370C孵育1小时后，PBST洗板5次370C孵育1小时后，PBST洗板5次显微镜下观察至斑点形成，去离子水清洗培养板室温干燥后在倒置显微镜下观察结果非无菌技术要点预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄）会影响斑点的形成提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培养箱应保证稳定，避免震荡稀释抗体及GABA冻干粉时建

7、议无菌操作，保存过程避免细菌的污染以保证其效用显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合ELISPOT实验技术广泛应用的主要原因之一就在于酶联斑点自动图象分析仪（ELISPOTREADER）及相应图象分析软件的出现Bioreader3000TMPRO酶联斑点自动图象分析仪适用于分析：酶联斑点(Elispot)克隆形成（CFU）病毒斑（ViralPlaque）德国Biosys公司产品原理示意图增强培养板上斑点成像对比度有效抑制因板孔侧壁反光造成的“幻影现象”，准确识别微孔边沿处斑点。专利3D双照明系统培养孔边沿识别功能选定培养

8、板参数设定BorderOffset数值BorderOffset数值一般为3-10mm3漂洗功能（WASHOUT）ELISPOT原始图象（显微镜下）Bioreader优化图象Bioreader结果分析图象可进行背景的优化和补偿局部背景校正度、washout背景补偿水平等参数可由用户根据需要设