普鲁兰酶毕赤酵母基因工程菌的构建和定点突变改造

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1、中图分类号Q墨!垒UDC579硕士学位论文学校代码!Q5曼三密级公珏普鲁兰酶毕赤酵母基因工程菌的构建和定点突变改造ExpressionofpullulanaseinPichia；ustorisresslonlapastortsand’computational--basedsite·-directedmutagenesis作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期鲨!圣!塞!兰矽吴丽双生物工程发酵工程资源加工与生物工程学院生物系周洪波教授答辩委员会主中南大学二。一三年五月硕士

2、学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：丞豳垫日期：j生堕年』月上日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和

3、借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者弥组双导师虢乓蛳吼丛年上月互日硕士学位论文摘要普鲁兰酶毕赤酵母基因工程菌的构建和定点突变改造摘要：在淀粉质原料的水解过程中，普鲁兰酶与其他淀粉酶类的协同作用，可以提高淀粉原料中支链淀粉的降解率，因此受到广泛的应用。本研究挑选来源于Bacillusacidopullulyticus菌株的I型普鲁兰酶基因pu

4、ll3进行异源表达，采用计算机辅助设计定点突变对酶进行性质的改造。主要研究内容有：(1)普鲁兰酶基因序列的优化、拼接、表达及酶学性质研究根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化该基因序列，利用DaulasymmetricPCR和OverlapextensionPCR将这些短的核苷酸序列拼接成全长普鲁兰酶基因序列，并利用电转化的方法转化入毕赤酵母X-33菌株中。重组普鲁兰酶的最适作用温度和pH分别为60℃和4．O．5．O。在温度低于60℃时，酶的活性能够保持在最高酶活的70％以上，但是在高于60℃时酶活力急剧下降

5、。在pH低于2．0或者高于7．0时基本丧失酶活性，在不同pH缓冲液下4℃处理lh后，在pH3．0．6．0有较好的稳定性。lmM的金属离子Ca2+、M92+、Fe3+和Fe2+对酶活性有一定的促进作用，Nr和K+对酶活性没有较大的影响，EDTA、CU2+、Ba2+和SDS对酶有抑制作用。在以普鲁兰多糖为底物条件下重组酶的米氏常数‰为O．26mg／rrm，最大反应速率‰aX为2．32I_tmol·rain-1．mg～。(2)普鲁兰酶定点突变位点的选择及构建对普鲁兰酶的3D结构进行分析，选取了催化活性口袋附

6、近的5个loop为突变位点，突变为Klebsiellapneumoniae普鲁兰酶氨基酸序列中相对应的氨基酸。此外，选取位于催化口袋底部487位点的谷氨酰胺和半保守位点495位点的天冬酰胺均突变为丙氨酸(M1和M2)。采用重叠延伸PCR的方法进行基因序列的定点突变，构建7种突变基因的毕赤酵母表达菌株。(3)定点突变改造的重组酶的性质研究通过与野生型普鲁兰酶的性质的比较，突变普鲁兰酶Pull3M1的比活力从2．21U／mg变为3．22U／mg，且酶的作用温度从60。C变为75℃。普鲁兰酶Pull3M2的

7、比活力提高到2．96U／mg。其他突变酶的比活力均有所下降。突变普鲁兰酶Pull3M45和Pull3M7的最适反应pH由4．0．5．O变为6．0。本研究采用计算机辅助设计的定点突变改造，所得到的普鲁兰酶的酶学性质的改变，为后续改造普鲁兰酶的性质奠定了一定的基础。U硕士学位论文摘要关键词：普鲁兰酶；Bacillusacidopullulyticus；毕赤酵母；定点突变；计算机辅助设计’分类号：III硕士学位论文ExpressionofpullulanaseinPichiapastorisandcompu

8、tational-basedsite-directedmutagenesisAbstract：砀epullulanasewaswidelyappiedinthestarchindustry,asitcanhydrolyzethea一1，6-glucosidicbondofamylopectinwhichleadsthelowutilizationrateofamylum．Inthisstudy,thegenefromBacillusacidopullul