基于DNA微阵列的甲基化定量检测方法研究

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1、中文摘要论文题目：基于DNA微阵列的甲基化定量检测方法研究硕士研究生：郑文莉导师姓名：陆祖宏教授学校名称：东南大学DNA甲基化是一种霞要的表现遗传现象，在细胞分化、发育及增殖过程中起着十分霞要的作用．近来研究发现，肿瘤细胞中基因组总体甲摹化水平的降低和某些基因启动子区发生过甲基化是肿瘤最早，也是最常见的分子改变之一。异常DNA甲基化与肿瘤抑制基因的转录失活密切相关，这种现象在肿瘤中非常普遍。因此，异常DNA甲基化的检测可以作为肿瘤诊断和预后的～个有用的分子标记。近年来相关的研究方法发展迅速，而基因芯片／微阵列的出现为DNA甲基化的高通量检测提供了强有力的技术平台。

2、本文基于微阵列的思路，发展了两种DNA甲基化定量分析的方法：1．基于微阵列的E-cadherin基因启动子区域甲基化定量分析DNA甲基化的定量分析对于肿瘤的早期诊断和预后分析十分重要，而E-cadherin基因是一重要的抑癌基因，在多种肿瘸发生过程中表达下调，已有实验证实其表达抑制与其启动子区域异常甲基化密切相关。我们基于生物芯片技术发展了对该基因启动子区CpG岛甲基化定量分析的方法。靶序列来自、5例正常人外周血与15例自血病样本，经咂硫酸氢盐修饰后，甲基化的胞嘧啶保持不变，而未甲基化的胞嘧啶在PCR扩增后则转变为胸腺嘧啶。根据这种变化，我们设计了5组寡聚核苷酸探

3、针。然后，利用完全甲基化的阳性克隆与非甲基化的阴性克隆制各标准曲线，通过比对来判断样本中E-cadherin基因的甲基化状态，微阵列结果通过MSP和克隆测序得以验证。结果表明，该微阵列能很好地榆测样品中E-cadherin基因的甲基化状态。所有样本均发生了一定程度的甲基化，一半以上的样本甲基化程度在50％以上，并且发现了潜在的甲基化热点位置。因此，该微阵列能很好地应用于样本众多个CpG位点的甲基化检测，相对MSP而言．该方法能更全面的获得特定片断内的甲基化信息，相比克隆测序而言，则具备快速敏感的优势。2．基于在膜原位亚硫酸氢盐翻转的多样本甲基化定量分析多样本的甲基

4、化定量分析一直是甲基化研究中的难点，而对多个样本逐一进行必要的亚硫酸氢盐翻转处理则增加了实验的操作难度。在此，我们开发了一种新方法，即在尼龙膜上固定样本后直接在膜原位亚硫酸氢盐处理，然后与标记地高辛的特异性探针杂交，通过化学发光的方法获取杂交信号，构建阳性与阴性参照建立标准曲线后，即可应用于后续的甲基化定量分析，获取多样本的甲基化信息。作为尝试性实验，本实验中所用样本为pUCl9质粒DNA。在甲基化酶处理出不同甲基化模式后点于膜上．根据实验设计成功检测并实现了定量化，表明该方法在不依赖液帽亚硫酸氢盐处理和PCR扩增的情况下，能够简单有效地进行cpG位点的甲基化定量

5、分析，并完全能够实现大规模样本甲基化定量分析。这种方法无需复杂的实验操作过程，快速简单是其最大的优点，同时实验结果也证实该方法具有高灵敏度的特点。关键词：基因芯片厂傲阵列甲基化定量分析白血病E-(mdherin亚硫酸氢盐翻转-111-东南』=学硕士学位论文英文摘要(Abstract)Title：Twomicrour珂-ImsedmethodsforquantitativeanalysisofDNAmethylationCandidateMaster：ZhengWen-liSupervisor：Prof&jsorLUZu-HongNameoftheUniversit

6、y：SoutheastUniversityAberrantDNAmethylationofCpGsiteisamongtheearliestandmostfrequentalterationsincancer．cpGislandhypermathylatiouiscloselyassociatedwithtranscriptionalinactivationofclassictumorsuppressorgenes，whichisacommonfeatureinhumancarcinomas．Therefore，thedetectionofpromoterhype

7、rmethylationofcancer-relatedgenemaybeusefulforcanccTdiaBnosisofthedctectionofi'ccurltTicc．Recently，avarietyofmethodsaredevelopedtoevaluatethemethylationstatusofgenes．Ontheotherbend，theadventofmicroarraytechnologyhasdriventhedevelopmentofaccessible，high-throughputandinexpensivetoolsfor

8、detec