DNA甲基化检测方法.ppt

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1、DNA甲基化检测方法DNA甲基化检测方法总览主要检测途径基于重亚硫酸盐转化的方法(金标准)不基于重亚硫酸盐转化的方法基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析水解核苷酸质谱分析基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理1基于重亚硫酸盐转化的甲基化分析原理2应用一:直接测序法（Directsequencing)用于甲基化分析的样本常常是混合样本，不适合直接直接进行sanger测序分析直接测序法图6PMVK基因扩增产物反向测序结果图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果应用二：重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-se

2、quencePCR，BSP)注：A：癌组织；B：癌旁组织；○：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果BSP克隆测序甲基化率三维图形优点:能准确的检测出每个DNA分子单倍体型的甲基化状态，同时能分析不同CpG位点之间的甲基化状态的联系。缺点：需要对PCR产物克隆，操作繁琐，费时费力，克隆子的数目影响结果的准确性。测序重复性差。应用三：甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)UMUMUMladder100150

3、200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果注：M表示甲基化，U表示未甲基化B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本；H2O为阴性对照；m为50bpMarker。SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态甲基化特异性PCR优点：①操作简便；②敏感性高；③Nested-MSP提高灵敏度，便于分析微量检材缺点：①引物设计要求高；②只能作定

4、性研究；③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；④只能了解部分位点的甲基化状态。MethyLight对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而实现甲基化的定量分析。优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照避免了电泳、酶切等操作缺点：PCRbias应用四：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA)结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法基于限制性内切酶的工具酶甲基化特异性的限制性内切酶(MDRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶甲基化敏感

5、性的限制性内切酶(MSRE)：可以识别甲基化的胞嘧啶基于限制性内切酶的甲基化分析方法MSRE-PCR原理图1-1MSRE-PCR原理图注：左图DNA无甲基化,DNA被切断,无法得到PCR产物;右图DNA有甲基化,DNA保持完整,可以获得PCR产物.应用举例二：采用甲基化敏感性限制性内切酶技术结合PCR的方法（MSRE-PCR）筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化差异的基因。图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图M21AE17B17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500b

6、p注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白酶识别位点内含有一个及以上CpG位点应用条件：结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法优点：①方法相对简单；②可进行甲基化水平的定量研究；③需要样本量少。缺点：①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序列的CG将被忽略；②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题；结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法应用五：RestrictionDigestionandReal-TimePCR(qA

7、MP)基本步骤举例：Theevalutionofdifferentiallymethylatedregion(MDR)ofimprintedgeneU2af1-rs1,intestisandliverofmousePrimeraredesignedtoflankNotl(N),Hhal(Hh),andMcrBc(M)RestrictionsitesintheDMRregion.LiverandtestisgenomicDNAtemplatesarePCRamplicatedfollowingdigestion

8、withnoenzyme(sham),Notl,Hhal(Hh)orMcrBc.AmplicationusingasecondprimerpairthathasbeendesignedtoasequencedevoidOfrestrictionsitesdemonstratesthatthetemplatesareofequalconcentration.ThedifferenceintheCtva