DNA甲基化方法研究现状

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1、•技术与方法《生命的化学》2003年23卷2期CHEMISTRYOFLIFE2003,23(2)149文章编号：1000-1336(2003)024)149-03DNA甲基化方法研究现状沈佳尧侯鹏祭美菊李松陆祖宏何农跃(东南大学生物医学与科学工程系吴建雄实验室.南京210096)摘要:DNA的异常甲基化与肿瘤的发生发展密切相关。DNA甲基化已成为研究热点•有关研究方法发展迅速。甲基牝研究方法大抵分为两大类：1・基因组DNA的甲基化检测;2.特定DNA片段的甲基化检测。目前的研究晝点已转移到特定基因尤其是抑癌基因的甲基化。关■词：甲基化;抑癌基因；撮阵列技术

2、中图分类号:Q75在肿瘤发生发展过程中，基因功能的改变包括基因机制和后生机制(epigeneticmechanism)⑴。DNA甲基化是目前已知脊椎动物唯一的后生改变。人类基因组中约4500个CpG岛存在异常甲基化,其中很多CpG位点的异常甲基化与癌症的发生发展密切相关⑴。因此,DNA甲基化已成为目前的研究热点。近年来甲基化分析方法发展迅速，大致可以分为两大类:基因组DNA及特定DNA片段的甲基化检测。1.基因组DNA的甲基化检测肿瘤组织中癌基因异常表达，基因组DNA的甲基化程度一般较相应的正常组织低。检测方法主要有以下三种。这些方法只能检测基因组DNA的

3、甲基化,并不能具体到特定的基因和位点。1.1限制性内切酶酶解法采用不能切割含5mCpG片段(5mC为5甲基胞唏睫)的甲基化敏感的限制性内切酶分别消化处理肿瘤和正常组织DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测，正常组织DNA酶解后小片段会多于肿瘤组织DNA,且呈弥散状⑵。这种方法较为粗略，要求两组的甲基化程度有明显的区别，而且这种方法只能考察限制酶识别序列内的CpG位点,假阳性较髙。1.2甲基化酶温育法在一定条件下用甲基化酶催化甲基基团由'H・S・腺昔甲硫氨酸(3H-SAM)掺入待测DNA⑶。由于反应是过量的，可最大限度地掺入甲基，故可推知掺入前DNA样本的甲基化情况,

4、并以肿瘤区与正常区cpm值之差了解该样本基收稿日期：2002-11-11国家973计划(G1998051204)和江苏省高新技术资助项目(BG2001010)资助作者简介:沈佳尧(1979-),女，硕士生;何农跃，通讯联系人。因组DNA甲基化水平下降的程度。这种方法较为简便，但精确度不高。1.3高效液相色谱(HPLC)法将DNA用酸或酶裂解为碱基,通过色谱柱分离出各种减基，由波长260nm的紫外光测定其吸收峰并定量，灵敏度为碱基⑷。由积分面积5mC/(5mC+C)的百分数检测基因组DNA中5mC的含量，即DNA甲基化的水平。此法是目前测定基因组DNA中5

5、mC总量最标准的方法。2.特定DNA片段的甲基化检测近年来人们发现在癌变组织中抑癌基因低表达甚至不表达，甲基化程度比正常组织明显增高⑸。DNA甲基化异常不仅能促进染色体缺失、重排和突变，还可直接灭活抑癌基因。典型的抑癌基因刃6、Rb和VHL等CpG位点甲基化普遍存在于多种缺乏突变和丢失的肿瘤中，因而DNA异常甲基化可能是肿瘤中抑癌基因失活的重要机制⑹。特定DNA片段的甲基化检测方法有以下几种。2.1DNA印迹采用甲基化敏感及非甲基化敏感的限制酶(HpaU和MspI)分别消化待测DNA,再进行DNA印迹杂交。消化后的DNA片段经琼脂糖凝胶分离后转印到纤维素膜

6、上，再与靶序列互补的探针杂交。利用放射自显影技术检测靶序列的甲基化位点⑺。这个方法的原理是根据非甲基化敏感的限制酶不能切割含5mCpG片段的特性,判断被测DNA序列中的一个或多个CpG位点的甲基化状态O缺点在于：(1)仅限于限制酶识别序列内的CpG位点；(2)要求甲基化的等位基因的比例达到百分之一以上；(3)要求每个DNA样品的量5・10昨；(4)不完全酶切可能导致假阳性。•TechniquesandMethods2.2限制性内切嗨・PCR利用甲基化敏感的限制酶与PCR联用的策略，把PCR引物设计在酶切位点的两侧，DNA被酶切后，只有发生甲基化不被切割的D

7、NA才能被PCR扩增⑻。此法检测CpG岛异常甲基化灵敏度高，可用过董的酶址（40单位/pLgDNA）完全消化组织DNA以避免酶切不完全岀现的假阳性，但这种方法也只限于检测限制酶所能识别的CpG位点。2.3测序法Frommer等⑼采用了亚硫酸氢盐对DNA进行化学修饰的方法，为研究DNA甲基化提供了一种全新的思路。其原理是单链DNA中未发生甲基化的胞唏咙可被亚硫酸氢盐脱氨基而转变成尿喘噪，而甲基化的胞喘噪保持不变。然后，利用PCR技术对所需要的那段序列进行扩增，将尿喘唳全部转化成胸腺喘噪。最后，对PCR产物进行测序并且与未经修饰的序列比较，便可判断该CpG位点

8、是否发生甲基化。在该技术的推动下，有关特定基因控制区CpG岛异常甲